Compuestos bioactivos en alimentos fermentados obtenidos a partir de sustratos naturales

La presente Tesis Doctoral se centra en el análisis de compuestos bioactivos en productos fermentados. Una primera parte ha tenido como objeto la determinación de los polifenoles no antocianos en un puré de fresa y en los fermentados alcohólicos y glucónicos obtenidos a partir de este sustrato. También se realizó el estudio de estabilidad de una bebida obtenida a partir de la fermentación glucónica. Dicha bebida fue diseñada como una alternativa viable para el aprovechamiento de los excedentes de producción de una fruta de marcado carácter perecedero y de elevada producción en España. La segunda parte se ha centrado en la capacidad de las levaduras vínicas como productoras de compuestos bioactivos a partir de determinados aminoácidos durante el proceso de fermentación alcohólica. A tal fin, se han identificado y determinado los polifenoles no antocianos mediante el empleo de diferentes técnicas y equipos, como HPLC-DAD, UPLC-QTRAP (QqQLIT) y UPLCQExactive. En todos los análisis de espectrometría de masas se utilizó el método MRM (Multiple Reaction Monitoring). Esta tarea identificativa tuvo como objeto el análisis del puré de fresa utilizado posteriormente como sustrato para la elaboración de dos fermentados diferentes (glucónico y alcohólico). El resultado de esta actividad nos permitió identificar un total de 106 compuestos fenólicos, 32 en el puré de fresa, 43 en los fermentados glucónicos, 66 en las fermentaciones alcohólicas y 64 en la bebida. Todo ello facilitó la identificación de 25 compuestos que, a la fecha de las publicaciones, no habían sido aún descritos en la fresa o productos derivados (12 flavonoles, 6 ácidos hidroxicinámicos, 2 taninos, 2 chalconas, 1 ácido hidroxibenzoico, 1 estilbeno y el ácido homovanillico). La valoración del impacto del proceso de fabricación industrial del puré de fresa sobre el contenido de los polifenoles no antocianos, permitió comprobar que este proceso es respetuoso con la composición de la fruta, preservando su capacidad antioxidante sin sustanciales cambios. Otro aspecto tratado en esta Tesis se ha centrado en el empleo del puré de fresa como sustrato para las fermentaciones. El análisis de los fermentados constató que los compuestos con mayores concentraciones fueron: la (+)-catequina, el hexósido del ácido p-cumárico y el HDDP-galoil glucósido, llegando a alcanzar un 62% del total de polifenoles no antocianos cuantificados. Además, la fermentación glucónica produjo un aumento de la concentración de la mayoría de los polifenoles no antocianos cuantificados ácido gálico 36%). En los fermentados alcohólicos se determinó que los compuestos más abundantes fueron: la (+)- catequina, (-)-epicatequin galato, galoil HHDP glucosa y el p-cumaroil glucósido. Por otra parte, produjo incrementos en compuestos (homovanillico 4% y el monogaloil glucósido 36%) procedentes de la degradación de otros fenoles y un descenso en la actividad antioxidante (12-18%). Puesto que la fermentación glucónica reserva la actividad antioxidante y mantiene inalterado el contenido de fructosa del sustrato, el fermentado puede ser empleado como el ingrediente principal para el desarrollo de una nueva bebida. La evaluación de la estabilidad incluyó la determinación de los polifenoles no antocianos a dos temperaturas de almacenamiento (ambiente y refrigeración). Ello unido a la valoración sensorial de la bebida, nos llevó a la conclusión de que el período óptimo de almacenamiento de la bebida de fresa fue de 30 días a temperatura ambiente y de 60 días en condiciones de refrigeración. El análisis reveló que cuatro compuestos experimentaron los cambios más importantes. Dos de ellos, la (+)-catequina y la procianidina B1, disminuyeron. Los otros dos, el ácido elágico y el p-coumárico, aumentaron. Estos fenómenos se apreciaron de forma más significativa a temperatura ambiente que en refrigeración. La segunda parte de esta Tesis aborda la producción de hidroxitirosol (HT) por la acción de las levaduras vínicas a partir de su aminoácido precursor, la tirosina. Mediante el análisis del contenido intracelular, se comprobó que las levaduras Saccharomyces cerevisiae cepas QA23 y RED FRUIT) y no Saccharomyces (Torulaspora delbrueckii), producen este compuesto (HT) durante la fermentación alcohólica. Posteriormente, el análisis de cuatro formas de inoculación (dos con cultivos puros de QA23 y RED FRUIT que se usaron como control, dos inoculaciones secuenciales; primero con T. delbrueckii y después con una de las levaduras S. cerevisiae) y una fermentación espontánea en mostos de uva de la variedad Tempranillo, demostró que la inoculación con una única cepa de levadura S. cerevisiae (QA23) fue más efectiva que las secuenciales en la producción de HT. Por otra parte, se realizaron fermentaciones en mostos de seis diferentes variedades de uva (Corredera, Moscatel, Chardonnay, alomino fino, Sauvignon Blanc y Vijiriega) con la levadura S. cerevisiae (AROMA WHITE), lo que demostró que las fermentaciones en mostos de uva Sauvignon Blanc fueron las que produjeron mayores concentraciones de HT. A raíz de los resultados obtenidos, se llegó a la conclusión de que tanto la levadura como la composición del mosto son factores que influyen en la producción del HT. Con la finalidad de ahondar en el conocimiento de la producción de bioactivos relacionados con los aminoácidos aromáticos (triptófano, tirosina y fenilalanina), se ha estudiado el contenido intra y extracelular de seis replicados de diferentes fermentaciones efectuadas en mosto sintético utilizando tres cepas de levaduras: dos Saccharomyces (QA23· y RED FRUIT) y una no Saccharomyces (Torulaspora delbrueckii). El resultado de esta tarea nos ha permitido comprobar que dos compuestos 2-minoacetofenona (que imprime mal sabor a los alimentos fermentados) y triptofol sulfonado están presentes en el medio intracelular, debiéndose a la acción directa de las levaduras. Este hallazgo contrasta con lo publicado hasta ahora, que sostenía que la síntesis se asociaba únicamente a la presencia de sulfitos en el vino. Adicionalmente, hemos podido describir que la de-acetilación de los N-acetil etil ésteres del triptófano y de la tirosina conforma otra vía para la producción de sus correspondientes ésteres etílicos. Y por último, se comprobó que la mayor concentración de melatonina se obtuvo en el segundo día de la fermentación. Para afrontar la dificultad de cuantificar ciertos metabolitos presentes en muy baja concentración (melatonina y serotonina) pertenecientes a la ruta catabólica de los aminoácidos aromáticos, se decidió optimizar un método de extracción intracelular. Para ello se realizó la comparación de la eficacia de tres métodos de extracción. Esto nos permitió demostrar que dos métodos de extracción a baja temperatura (-20ºC y 4ºC) fueron más respetuosos con la integridad de los compuestos relacionados con el metabolismo del triptófano, la melatonina y de la tirosina que el efectuado con etanol a ebullición. En general, los resultados aportados por la presente Tesis Doctoral proporcionan una solución viable para el aprovechamiento de los excedentes de producción de la fresa, profundizando, además, en el conocimiento del comportamiento de las levaduras en relación al potencial bioactivo y al carácter sensorial de los alimentos producidos.

This Doctoral Thesis focuses on the analysis of bioactive compounds in fermented foods. The objective of the first part is to determine the non-anthocyanin polyphenols in the strawberry purée and in the gluconic and alcoholic fermented products obtained from this substrate. We also studied the stability of a drink elaborated from gluconic fermentation that was used to produce a drink designed as a viable alternative to take advantage of the surplus of the production of this perishable fruit so produced in Spain. The second part focuses in the ability of the winemaking yeast to produce the bioactive compounds in the alcoholic fermentation process. In order to do so, we have identified the composition of the non-anthocyanin polyphenols by using different techniques and instruments such as the HPLC-DAD, the UHPLCQTRAP (QqQLIT) and the UHPLC-QExactive. The method MRM (Multiple Reaction Monitoring) was used for all spectrometric mass analysis. The purpose was to analyse the strawberry purée used later as a substrate to elaborate those two different fermented products (gluconic and alcoholic). The outcome of this activity allowed us to identified 106 compounds, of which 32 were in the strawberry purée, 43 in the gluconic fermented product, 66 in the alcoholic fermented product and 64 in the drink. All of this enabled us to identify 25 compounds which had never been referred to before, to this date, in the strawberry purée or its derivatives (12 flavonols, 6 hydroxycinnamic acids, 2 tannins, 2 chalcones, 2 hydroxybenzoic acid, 1 stilbene and the homovanillic acid). The study of the impact of the process of industrial production of the strawberry purée in the content of the non-anthocyanin compound, allowed us to prove that this process preserves most of the composition of the fruit and its antioxidant properties. Another subject treated in the Thesis focused on the use of this strawberry purée as a substrate for the fermentation processes. The analysis of the processes showed that the compounds with higher concentration were the (+)-catechin, the p-coumaric hexoside and the HHDP-galloyl glucoside, reaching 62% of the total of the non anthocyanin polyphenols quantified. The gluconic fermentation produced an increase in the concentration of the most of polyphenols non anthocyanin quantified (36% gallic acid). In the alcoholic fermented products, it was found out that the most abundant compounds were the (+)-catechin, the (-)-epicatechin gallate, the HHDP-galloyl glucose and the p-coumaroyl glucoside. Moreover, the alcoholic fermentation produced an increased in the compounds (homovanillic 4% and the monogalloyl glucose 36%) coming from the degradation of other phenolic compounds and the decreased of the antioxidant activity (12-18%). Because the gluconic fermentation process preserves the antioxidant activity and does not alter the content of the fructose of the substrate, we were able to used the gluconic fermentation product as the main ingredient for the elaboration of a new drink. In order to assess the stability of the drink, we studied the non-anthocyanin polyphenols at two temperatures of storage (room and refrigeration temperature). This together with the sensorial assessment of the drink, led us to the conclusion that the optimal storage period was of 30 days at room temperature and 60 days at refrigeration temperature. The analysis revelled important changes in four compounds. Two among them, the (+)- catechin and the procyanidin B1 decreased. The other two, the ellagic acid and the p-coumaric acid increased. This phenomenon was more particularly observed at room temperature than in refrigeration. The second part of the Thesis focuses on the production of the hydroxytyrosol (HT) resulting from the action of the winemaking yeast over tyrosine. The analysis of the intracellular media confirm that the Saccharomyces cerevisiae strains of yeast (QA23 and RED FRUIT) and the non-Saccharomyces strain (Torulaspora delbrueckii) produced this compound (HT) through the alcoholic fermentation process. Afterwards, we studied four ways of inoculation (two pure cultures with strains QA23 and RED FRUIT that used as control, two sequential inoculation first with T. delbrueckii and then with one of the S. cerevisiae strains) and spontaneous fermentation in must of Tempranillo variety grape. We found that inoculations with a single strain of yeast S. cerevisiae (QA23) were more effective than the sequential ones in the production of HT. Besides, were carried out the fermentation of 6 winegrapes (Corredera, Moscatel, Chardonnay, Palomino fino, Sauvignon Blanc y Vijiriega) using the strain of yeast S. cerevisiae (AROMA WHITE). This showed that the fermentations of Sauvignon Blanc grape must was the one that produced higher concentration of HT. As a consequence of the results obtained, it was concluded that the strain of yeast and the composition are factors that influence the HT production. With the aim to get a better knowledge of the bioactive synthesis related to aromatic amino acids (tryptophan, tyrosine and phenylalanine), we studied the intra and extra cellular media of six replicates of different fermentations of synthetic must produce from three winemaking yeasts, two strains of Saccharomyces (QA23 and RED FRUIT) and one of the non- Saccharomyces (Torulaspora delbrueckii). The result of this task helped us to prove that two compounds, 2-aminoacetophenone (that gives a bad flavour to fermented foods) and tryptophol sulfonated are present in intracellular media, as a result of the direct action of the yeast. This statement contrasts with what has been published up to now, which held that synthesis was associated only with the presence of sulphites in wine. Additionally, we have been able to describe the de-acetylation of N-acetyl-ethyl esters of tryptophan and tyrosine as are the way to produce their own ethyl esters. And finally, it was proved that the highest concentration of melatonin was measured in the second day of the fermentation process. To face the difficulty to quantify some metabolites whose concentration is very low (melatonin and serotonin), belonging to the aromatic amino acids catabolism pathway, we decided to optimise the intracellular extraction method . To do so, we compared the efficiency of three extraction methods. We found that two methods at low temperature (-20ºC and 4ºC) were more respectful towards the integrity of the compounds related to tryptophan, melatonin and tyrosine metabolism than the extraction with boiling ethanol. On the whole, the results brought in this Doctoral Thesis bring a viable solution to optimize the excess of the strawberry production, and it increases the knowledge of the performance of the yeast in relation to the bioactive potential and the sensorial character of the produced food.

Premio Extraordinario de Doctorado US