Identificación y caracterización de los elementos implicados en el inicio de la síntesis de almidón en plantas

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Resumen de la tesis doctoral ¿Identificación y caracterización de los elementos implicados en el inicio de la síntesis de almidón en plantas¿. El almidón constituye la principal reserva de carbono en plantas, y desempeña un papel fundamental en el metabolismo de las mismas, suministrando esqueletos carbonados y energía a la planta durante la noche, cuando la maquinaria fotosintética está inactiva (almidón transitorio, localizado en los cloroplastos de tejidos fotosintéticos) o los nutrientes necesarios para la germinación de nuevas plantas (almidón de reserva, localizado en los amiloplastos de endospermo de semillas o en raíces y tubérculos). El almidón es el componente principal de algunos de los cultivos de mayor importancia en nuestra sociedad: patata, maíz, trigo, arroz,... constituyendo la principal fuente de carbohidratos en la dieta humana y es, también, una importante materia prima a nivel industrial. Desde el punto de vista industrial, es una materia prima barata y renovable, con propiedades fisicoquímicas únicas y una creciente explotación tanto en el sector agroalimentario (industria alimenticia) como en diversos procesos de manufactura (industria no alimenticia). Además, el uso del almidón como materia prima para la obtención de biocombustibles (bioetanol; Smith, 2008) es una de las vías de investigación actuales para la obtención de combustibles alternativos. Todo ello hace del almidón un polisacárido muy importante en la sociedad actual y hace sorprendente el hecho de que, a día de hoy, aún no se conozca completamente su estructura, cómo se sintetiza y qué determina la cantidad acumulada por las plantas. El gránulo de almidón es una compleja estructura formada por dos polímeros: amilosa, formada por residuos de glucosa unidas por enlace glucosídico alfa¿(1,4), escasamente ramificada y que representa el componente minoritario del gránulo (entre un 10-18%), y la amilopectina, componente principal del gránulo, formada por cadenas de unidades de glucosa unidas por enlaces alfa-(1,4) y con ramificaciones establecidas mediante enlaces alfa-(1,6). La molécula de amilopectina muestra una estructura semicristalina debida al denso empaquetamiento de las cadenas de ramificaciones en ¿clusters¿ de dobles hélices. El tamaño del gránulo de almidón, porcentaje amilosa/amilopectina, grado de ramificación de la amilopectina y tamaño de las ramificaciones son los parámetros que determinan las propiedades físico-químicas del almidón, como temperatura de gelatinización, viscosidad o retrogradación, y por tanto determinan en gran medida su posterior uso industrial. Los modelos actuales sugieren que la molécula de amilopectina presenta una arquitectura racémica, es decir, que las cadenas (de entre 12 y 20 unidades de glucosa) se organizan en racimos, los cuales se unen a cadenas de mayor longitud (40 o más unidades de glucosa) que abarcan varios racimos. Esta distintiva distribución polimodal de las cadenas en la molécula de amilopectina según su longitud, permite la organización del polímero en gránulos insolubles y semi-cristalinos. En el gránulo, las cadenas cortas adyacentes en los racimos forman hélices dobles que se empaquetan juntas en series ordenadas dando lugar a las denominas lamelas cristalina. Dentro de las lamelas cristalinas, las dobles hélices se empaquetan densamente. Entre las lamelas cristalinas aparecen las lamelas amorfas, sin estructura semi- cristalina dado que contienen la mayoría de los puntos de ramificación. La alternancia de lamelas cristalinas y amorfas tiene una periodicidad de 9 nm independientemente de la procedencia del almidón (Jenkins et al., 1993). La biosíntesis de almidón es un proceso complejo que requiere la intervención de diferentes actividades enzimáticas: almidón sintasas, enzimas ramificantes del almidón, y enzimas desramificantes. Cada una de estas actividades está presente en diversas isoformas. El proceso de biosíntesis de almidón está excepcionalmente bien conservado entre las diferentes especies, encontrándose el mismo tipo de isoenzimas en todos los organismos que acumulan almidón, por lo que resultados obtenidos en una especie son fácilmente extrapolables a otra. Recientemente se ha realizado un considerable avance en el conocimiento del papel que cada una de las isoformas desempeñan en la síntesis del gránulo de almidón y en la determinación de su estructura semicristalina final (Zeeman et al., 2010). Sin embargo, un proceso clave sigue siendo completamente desconocido: el mecanismo de iniciación del gránulo. Las enzimas que elongan las cadenas de glucanos (las almidón sintasas) requieren de un extremo no reductor al cual añadir moléculas de glucosa desde el donador glucosílico (ADP-glucosa) (Ball & Morell, 2003). Dicho requerimiento implica la existencia de un mecanismo de síntesis del cebador glucosídico. Al comienzo de este trabajo, poco o nada se sabía acerca de dicho mecanismo. Diferentes proteínas han sido propuestas como posibles proteínas implicadas en la síntesis de almidón, pero ninguna de ellas ha sido confirmada. En muchos de los casos se ha mostrado que las proteínas propuestas son en realidad glucosiltransferasas implicas en la biosíntesis de la pared celular, sin ninguna relación directa con la biosíntesis del almidón. Existen fuertes evidencias de que el proceso de inciación de la síntesis del gránulo está sometido a regulación. El número de gránulos de almidón por plasto es dependiente del tipo celular y la especie, por ejemplo, mientras que los amiloplastos del endospermo de maíz contienen un único gránulo, los de arroz y avena contienen varios. Otro claro ejemplo de regulación del proceso es la aparición de dos tipos diferentes de gránulos de almidón en las semillas de trigo, cebada y avena, cada uno de los cuales es sintetizado en un momento diferente del desarrollo de la semilla y posee un tamaño, forma y localización característicos (D¿Hulst & Mérida, 2010). Los cloroplastos de Arabidopsis thaliana poseen 5-7 gránulos por cloroplasto. Un trabajo previo de nuestro grupo (Roldán et al., 2007) mostró, por primera vez, la implicación de una SS soluble, la almidón sintasa de clase IV (SSIV), en la iniciación del gránulo de almidón. La ausencia de la SSIV (mutante ssIV de A.thaliana) no provoca ningún cambio en la estructura del almidón (contenido de amilosa, distribución de longitud de cadenas,...), a diferencia de lo que ocurre con el resto de SSs, pero su ausencia provoca la acumulación de un único gránulo por cloroplasto de mayor tamaño que los presentes en plantas silvestres. Este trabajo demostró la implicación directa de SSIV en la síntesis del número correcto de gránulos de almidón por cloroplasto y permitió proponer que SSIV sería necesaria para establecer una estructura inicial que permita la nucleación de la cristalización y la síntesis de un nuevo gránulo. La almidón sintasa de Clase IV (SSIV) ha sido la última en ser descrita y la menos estudiada de las cinco clases de SSs (Li et al., 2003; Ball & Morell, 2003; Hirose & Terao, 2004; Dian et al., 2005). Todas las secuencias SS4 caracterizadas hasta la fecha poseen 16 exones, separados por 15 intrones. En todas ellas se ha predicho la presencia de una secuencia señal de transporte al cloroplasto (CTP). El tamaño de la proteína madura (sin CTP) es similar para diferentes especies/isoformas: 108,1/104,2 KDa para OsSSIV-1/-2 (Hirose & Terao, 2004), 98,3 KDa para TaSSIV-2 (Leterrier et al., 2008) y 113 KDa AtSSIV (Roldán et al., 2007). La secuencia de AtSSIV presenta una alta homología con las secuencias de SSIV de otras especies: 56,8 % de identidad con OsSSIV-1, 58,3 % con OsSSIV-2, 58,2 % con TaSSIV-2 y 71 % con VuSSIV (de Vigna unguiculata). La mayor homología entre estas secuencias aparece en el dominio carboxilo, que también presenta una alta homología con el dominio carboxilo del resto de clases de SSs y con la GS bacteriana. Este dominio carboxilo es responsable de la actividad SS y posee los dominios GT-5 y GT-1, característicos de la superfamilia de glucosiltransferasa GT5. Dentro de la secuencia del dominio carboxilo, se localizan también los dos motivos, altamente conservados, implicados en la unión de la ADP-Glc: motivo KXGGL amino y motivo XXGGL carboxilo (Leterrier et al., 2008). Al igual que ocurre con las demás SSs, el dominio amino de SSIV es exclusivo y, aunque más variable que el dominio carboxilo, presenta regiones altamente conservadas entre especies. Los objetivos de esta tesis han sido: identificar el/los elemento/os responsables de la síntesis de los gránulos de almidón observados en el mutante ssIV de Arabidopsis thaliana, carente de actividad SSIV; obtener y caracterizar diferentes mutantes dobles y triples carentes de SSIV y una o dos de las demás SSs solubles en Arabidopsis thaliana; estudiar y entender las características fenotípicas de los mutantes carentes de SSIV de Arabidopsis thaliana; estudiar la actividad y la localización de SSIV in vivo; estudiar las características enzimáticas de SSIV in vitro: obtención de la Km para ADP-Glucosa y amilopectina, actividad autoglucosilante y posible interacción consigo misma; y analizar la funcionalidad del dominio N-terminal de SSIV en el inicio del gránulo de almidón. Durante el desarrollo de este trabajo se han empleado técnicas de biología molecular, genética, bioquímica de proteínas, cromatografía, de análisis de intercambio de gases mediante IRGA y de emisión de fluorescencia mediante PAM. Los resultados obtenidos permiten concluir: ¿ La almidón sintasa (SS) soluble de clase IV (SSIV) es imprescindible para la nucleación inicial del gránulo de almidón. En su ausencia, el número de gránulos se ve reducido a uno o dos los cuales presentan ciertas peculiaridades respecto a los gránulos de plantas silvestres: diferente estructura del hilum, mayor tamaño, tasas de síntesis y degradación inferiores y la imposibilidad de degradarlos completamente. ¿ En ausencia de SSIV, la nucleación se vuelve un proceso poco frecuente y dependiente de la presencia del resto de SSs, principalmente de la presencia de SSIII. La eliminación de SSIII en un fondo genético ssIV hace que el contenido de almidón sea inferior al límite de detección de los ensayos empleados. ¿ El centro de nucleación formado en ausencia de SSIV difiere del formado en su presencia, provocando que los gránulos de almidón de los mutantes ssIV posean una diferente estructura del hilum y la imposibilidad de la completa degradación de los mismos in vivo. ¿ El dominio amino de SSIV posee un péptido de tránsito al cloroplasto (CTP) (aminoácidos 1 a 42), un dominio long coiled coil (aminoácidos 187 a 409 aproximadamente) y un dominio de estructura desconocida altamente conservado entre diferentes especies y esencial para la actividad glucosiltransferasa de la proteína (aminoácidos 471 a 594). ¿ El dominio carboxilo de SSIV no posee actividad glucosiltransferasa in vitro, pese a su alta homología con la glucógeno sintasa bacteriana. La región entre el dominio carboxilo y el long coiled coil parece fundamental para la afinidad de la SSIV por ADP-glucosa (ADP-Glc) y, por tanto, para su actividad glucosiltransferasa. ¿ La complementación de la mutación ss4 no es posible con los dominios amino y carboxilo de la proteína por separado, requiriendose la proteína completa para la restauración de un fenotipo WT en el mutante ssIV. ¿ SSIV forma parte de un complejo macromolecular asociado a la membrana tilacoidal. SSIV no interacciona consigo misma, no está anclada al gránulo de almidón (al menos, no mediante una interacción fuerte), ni a ningún otro polímero de glucosa, y no presenta dominios transmembranas. ¿ Las características fenotípicas observadas en los mutantes carentes de SSIV son provocadas por la acumulación de ADP-Glc resultante del bloqueo de la síntesis de almidón. El bloqueo de la síntesis de almidón, provocado por la ausencia de SSIV, hace que se alcancen altas concentraciones de ADP-Glc en el interior del cloroplasto, lo que se traduce en unas bajas concentraciones de ADP y ATP cloroplastídicos. La disminución de la concentración de ADP provoca el enlentecimiento de la cadena de transporte de electrones, que desencadena las respuestas de fotoprotección por parte de la planta, entre ellas cambios en el contenido de pigmentos antena y fotoprotectores. La disminución del contenido de ATP del cloroplasto provoca el enlentecimiento del ciclo de Calvin-Benson, llevando a la disminución de la fijación de CO2 y a la menor tasa de crecimiento. Bibliografía Ball, S., Morell, M. 2003. From bacterial glycogen to starch: understanding the biogenesis of the plant starch granule. Ann. Rev. Plant Biol. 54:207-33 D¿Hulst, C., Mérida, Á. 2010. The priming of storage glucan synthesis from bacteria to plants: current knowledge and new developments. New Phytologist 188:13-21 Dian, W., Jiang, H., Wu, P. 2005. Evolution and expression analysis of starch synthase III and IV in rice. J Exp Bot 56:623-32 Hirose, T., Terao, T. 2004. A comprehensive expression analysis of the starch synthase gene family in rice (Oryza sativa L.). Planta 220:9-16 Jenkins, P.J., Cameron, R.E., Donald, A.M. 1993. A Universal Feature in the Structure of Starch Granules from Different Botanical Sources. Starch - Stärke 45:417-20 Leterrier, M., Holappa, L., Broglie, K., Beckles, D. 2008. Cloning, characterisation and comparative analysis of a starch synthase IV gene in wheat: functional and evolutionary implications. BMC Plant Biol 8:98 Li, Z., Sun, F., Xu, S., Chu, X., Mukai, Y., Yamamoto, M., Ali, S., Rampling, L., Kosar-Hashemi, B., Rahman, S., Morell, M. 2003. The structural organisation of the gene encoding class II starch synthase of wheat and barley and the evolution of the genes encoding starch synthases in plants. Functional & Integrative Genomics 3:76-85 Roldán, I., Lucas, M., Delvalle, D., Planchot, V., Jimenez, S., Perez, R., Ball, S., D'Hulst, C., Mérida, A. 2007. The phenotype of soluble starch synthase IV defective mutants of Arabidopsis thaliana suggests a novel function of elongation enzymes in the control of starch granule formation. The Plant journal : for cell and molecular biology 49:492-504 Santelia, D., Zeeman, S.C. 2011. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology 22:271-80 Smith, A. 2008. Prospects for increasing starch and sucrose yields for bioethanol production. The Plant journal : for cell and molecular biology 54:546-58 Zeeman, S.C., Kossmann, J., Smith, A.M. 2010. Starch: its metabolism, evolution, and biotechnological modification in plants. Annu Rev Plant Biol 61:209-34

Premio Extraordinario de Doctorado US