Characterization of the involvement of the plant cell wall and its derived compounds in the virulence of Dickeya dadantii 3937

Las bacterias fitopatógenas representan importante problema para la agricultura y la seguridad alimentaria en todo el mundo, ya que afectan a una amplia gama de cultivos de elevada importancia económica. Para sobrevivir y hacer frente a las cambiantes condiciones ambientales, las bacterias han desarrollado mecanismos de percepción complejos que les permiten percibir señales tanto externas como internas. Gracias a los sistemas de transducción las bacterias son capaces de percibir las diferentes señales ambientales y, en consecuencia, de ajustar su comportamiento. La quimiotaxis es un sistema de transducción complejo, en el que la percepción de una molécula señal o ligando, genera una cascada de señalización intracelular que, en última instancia, deriva en el control del motor flagelar, permitiendo a la bacteria cambiar su dirección de movimiento. Las proteínas que hacen posible el proceso de quimiotaxis se conocen como quimiorreceptores o MCPs (Methyl accepting Chemotaxis Proteins). Los ligandos percibidos por estas proteínas son diversos y de distinta índole, como oxígeno, oligosacáridos, aminoácidos o moléculas más complejas como los compuestos fenólicos. Para llevar a cabo una infección exitosa, las bacterias fitopatógenas entran en el apoplasto de las plantas a través de heridas o de aperturas naturales. Los mecanismos de percepción, como la quimiotaxis, impulsan esta entrada y controlan la colonización del huésped vegetal. Sin embargo, para lograr esta entrada en el apoplasto, las bacterias, y los patógenos en general, han de superar la barrera que constituye la pared celular de la planta. La pared celular constituye el primer sitio de encuentro entre las plantas y sus patógenos microbianos, y es un componente esencial de las células vegetales que regula diversos procesos biológicos. En esta tesis, hemos estudiado la importancia de la composición de la pared celular en el progreso de la infección bacteriana y el papel en la virulencia y la patogénesis de la percepción de compuestos derivados de la misma, utilizando la bacteria modelo Dickeya dadantii 3937. La enfermedad causada por esta bacteria tiene efectos significativos en diversos cultivos importantes a nivel global. Dd3937 es un necrótrofo agresivo que puede vivir como epífito hasta que las condiciones sean favorables para colonizar los tejidos de la planta y generar la infección. Posee un único clúster de quimiotaxis y 47 quimiorreceptores. Hemos definido el perfil quimiotáctico de la bacteria y establecido que posee quimioatracción hacia compuestos derivados de la pared celular. Basándonos en análisis bioinformáticos, seleccionamos tres quimiorreceptores como candidatos putativos a estar involucrados en esta percepción. De estos MCPs, caracterizamos un quimiorreceptor con dominio LBD de tipo NIT, Dd15070, que une nitrato y nitrito con más afinidad hacia nitrato. Esta caracterización, nos permitió desvelar el papel clave de la percepción de nitrato, no sólo para la entrada en el apoplasto de la planta, sino también para el éxito de la infección causada por esta bacteria. Análisis en la expresión génica mostraron que la percepción de nitrato controla no sólo la expresión de los genes de la enzima nitrato reductasa, implicados en los procesos metabólicos respiratorios y asimilatorios, sino también la expresión de gyrA, hrpN y bgxA, tres determinantes de virulencia bien conocidos en este patógeno. Este quimiorreceptor también está implicado en la quimioatracción hacia xilosa, aunque aún no se ha descrito el mecanismo específico de su función en este proceso. El análisis de los quimiorreceptores Dd11740 y Dd11745 demostró que también están implicados en la quimiopercepción de xilosa, ya que los ensayos de quimiotaxis con las cepas mutantes para estos genes mostraron una quimiopercepción reducida hacia este compuesto y sus derivados. Los ensayos en plantas de Solanum tuberosum, demostraron que la cepa mutante 11740 tiene una entrada y virulencia reducida respecto a la cepa silvestre, lo que sugiere su implicación en la percepción de este monosacárido in vivo. La caracterización bioquímica de ambos quimiorreceptores mostró que la unión a estos compuestos podría ser indirecta con la participación de proteínas solubles específicas. Las SBPs, están implicadas en el transporte, proporcionando sustratos a los receptores transmembrana. En este trabajo, hemos caracterizado 2 SBPs (SBP-16305 y SBP-XylF) que unen xilosa. Las cepas mutantes en estos SBPs están alteradas en su quimiotaxis hacia xilosa y están deterioradas en su capacidad para entrar en el apoplasto de la planta, lo que sugiere que participan en la percepción de este monosacárido. Además, hemos analizado la respuesta a la infección causada por Dd3937 de un conjunto de mutantes de Arabidopsis thaliana previamente caracterizados, afectados en la pared celular. Los resultados apuntan a un papel relevante de la composición de la pared celular en la resistencia frente a este patógeno, sugiriendo que los componentes y estructura de la pared celular, que son la diana de las enzimas pectolíticas, determinan en gran medida el éxito de la infección y que a la vez podrían ser una fuente de quimioefectores percibidos por la bacteria en su entrada a la planta. En general, este trabajo de investigación ha contribuido a aumentar el conocimiento sobre la quimiotaxis de Dd3937 durante la infección, desvelando el papel de la pared celular de la planta como fuente de quimioatrayentes que impulsan el proceso de entrada en el apoplasto. Además, hemos iniciado la caracterización de dos quimiorreceptores implicados en la percepción de xilosa y hemos establecido que la quimiotaxis hacia este monosacárido podría ser indirecta y estar mediada por proteínas solubles. En el transcurso de esta investigación, también hemos caracterizado un quimiorreceptor que podría estar implicado indirectamente en la quimiotaxis hacia xilosa y que une directamente nitrato y nitrito. La función de este quimiorreceptor es esencial para el desarrollo de una exitosa virulencia en plantas de patata, sugiriendo que la percepción de nitrato tiene un papel relevante durante el proceso de infección para esta bacteria. ABSTRACT Phytopathogenic bacteria, are a major issue for agriculture and food security worldwide, affecting a wide range of different and economically important crops. To survive and cope with the changing environment, bacteria have evolved complex perception mechanisms to track external and internal conditions. Signal transduction systems, enable bacteria to sense environmental signals and adjust cellular behavior in response to these cues. The chemotaxis system is a complex signal transduction system, that allows bacteria to perceive and respond to these cues. The perception of a signal generates an intracellular signalling cascade that ultimately derives in the control of the flagellar motor, allowing the bacteria to change its movement direction. The proteins that make this perception process possible are known as chemoreceptors or Methyl accepting Chemotaxis Proteins (MCPs) and they constitute the initial step of the chemotaxis system. The ligands perceive by these proteins are diverse and of different nature, such as oxygen, oligosaccharides, amino acids or more complex molecules like phenolic compounds. To conduct a successful infection, phytopathogenic bacteria enter into the plant apoplast through wounds or through natural openings. The perception mechanisms, like the chemosensory pathway drive this entry and control the colonization of the plant host. However, to achieve this entry into the plant apoplast, bacteria, and pathogens in general, must overcome the plant cell wall. The cell wall is often the initial site of encounter between plants and their microbial pathogens, and it is an essential component of plant cells that regulates diverse biological processes. In this thesis, we have studied the importance of the cell wall composition in the progress of bacterial infection and the role in virulence and pathogenesis of the perception of plant cell wall derived compounds, using the model bacteria Dickeya dadantii 3937. The disease caused by this bacterium affects a wide range of important crops, having a significant economic impact. Dd3937 is an aggressive necrotrophic that can live as an epiphyte until the conditions are favorable to colonize the plant tissues and generate the infection. Dd3937 possess one chemotaxis cluster and 47 chemoreceptors. We have defined the chemotactic profile of the bacterium, unveiling the chemoattraction towards cell wall-derived compounds. Based on bioinformatics analysis we have selected we selected three chemoreceptors as putative candidates to be involved in this perception. From the selected MCPs, we have characterised a NIT sensor domain containing chemoreceptor, Dd15070, that binds nitrate and nitrite with a slight ligand preference for nitrate, that allowed us to unveil the key role of nitrate sensing not only for the entry to the plant apoplast through wounds but also for the infection success. Gene expression analysis showed that nitrate perception controls not only the expression of nitrate reductase genes involved in respiratory and assimilatory metabolic processes, but also the expression of gyrA, hrpN and bgxA, three well known virulence determinants in Dd3937. This chemoreceptor is also involved in the chemoattraction to xylose although the specific mechanism of its function in this process has not yet been described. Chemoreceptors Dd11740 and Dd11745 have shown to also be involved in xylose chemoperception, since chemotaxis assays with the mutant strains displayed reduced chemoperception to this compound and its derivatives. Plant assays in Solanum tuberosum, have shown that mutant 11740 is impaired in entry and virulence respect to the wild type strain suggesting its involvement in perception of this monosaccharide in vivo. The biochemical characterization of both chemoreceptors showed that binding to the chemoeffectors might be indirect with the involvement of specific soluble proteins. SBPs, are involved in transport, providing substrates to transmembrane receptors. In this work, we have characterised 2 SBPs (SBP-16305 and SBP-XylF) that bind to xylose. The mutant strains in these SBPs are altered in chemotaxis to xylose and are impaired in entry to plant apoplast which suggest their participation in the chemoattraction process to this monosaccharide. Furthermore, we have analysed the response to Dd3937 infection of a previously characterized set of cell wall Arabidopsis thaliana mutants. Results point to a relevant role of the cell wall composition in the resistance to this necrotroph pathogen suggesting the adaptation of the pathogen to a specific cell wall structure which is the target of pectolytic enzymes and might be the source of chemoeffectors driving the entry process. Overall, this research work has contributed to increase the knowledge regarding Dd3937 chemotaxis during the infection of plant host unveiling the role of the plant cell wall as a source of chemoattractants driving the entry process to the apoplast. Moreover, the characterization of specific chemoreceptors involved in this process has allowed us to propose the implication of solute binding proteins in the perception of xylose. Furthermore, during the course of this research, we have characterized a chemoreceptor that might be indirectly involved in the chemotaxis to xylose and directly binds nitrate and nitrite. The function of this chemoreceptor is essential for a full virulence in potato plants suggesting a relevant role of nitrate perception during Dd3937 infection process.