Pathogenesis of German Flavivirus (co-) Infections in Geese

English. The two flaviviruses Usutu virus (USUV) and West Nile virus (WNV) can cause disease and possibly even death in birds and humans. Both viruses circulate in an enzootic cycle between birds as amplifying hosts and mosquitoes as vectors. Mosquitoes may also transmit both viruses to mammals including humans. Alternatively, humans can be infected via blood transfusion or organ transplantation. Mammals are dead-end hosts but can also develop severe clinical signs. USUV was first proven in Germany in mosquitoes in 2010 and in birds in 2011. Since 2018 USUV is present throughout the entire country. WNV, however, was only first time detected in dead birds in eastern Germany in 2018 and has been circulating in there ever since. Therefore, nowadays both viruses co-circulate in overlapping geographic regions and ecological ranges (i.e., avian hosts and mosquitoes), sharing the same environment. The experiments conducted in this doctoral thesis were therefore intended to investigate the pathogenicity of these two viruses occurring (simultaneously) in Germany as well as their pathogenesis for birds. In the first study (manuscript 1), different cell lines were used to investigate the viral growth of the new WNV isolate that was isolated in Germany in 2018. The growth kinetics of the German WNV strain were compared to other European WNV and USUV strains. These in-vitro infection experiments were performed on a mammalian (Vero B4), an avian (GN-R) and two mosquito cell lines (C6/36 and CT). The growth kinetics of WNV and USUV were similar on all tested cell lines, independent of the lineage or strain. However, on the vertebrate cells, the WNV isolates developed a more rapid increase than the USUV isolates. Generally, a faster viral replication with a subsequent decline associated with cell death was observed on the vertebrate cells, especially the GN-R (geese) cells compared to a steady increase of viral replication on the mosquito cells. Subsequently, simultaneous co-infections were performed with selected WNV and USUV strains with the same multiplicity of infection (MOI) and with a lower MOI for WNV. The study verified the viral interaction between WNV and USUV in-vitro with a competitive advantage of WNV, possibly due to its faster replication. In addition, it was demonstrated that the in-vitro viral interaction between these viruses appeared not to be lineage or strain dependent. However, this effect depended on the WNV titer used. To test the susceptibility of geese to the German WNV isolate, 15 young geese were infected with this newly introduced WNV isolate from 2018 in the second study (manuscript 2) Thus, not only the risk to humans and animals posed by this virus was investigated but also the precise pathogenesis in geese. As was shown in previous studies, geese are the most susceptible species to WNV of three tested poultry species. After subcutaneous infection of the birds, blood and swab samples were taken regularly and analyzed by molecular and serological methods. In addition, three geese each were removed from the experiment at specific time points for detailed virological, serological, as well as pathological and immunohistochemical examinations. After WNV infection, the geese continuously gained weight and only a few presented minor nonspecific clinical signs 5–10 days post infection (dpi) having no further relevance for the course of the experiment. However, one goose stood out with weight loss (4 dpi) and a staggering gait (5–6 dpi) worsening up to apathetic behavior, isolation from the group, and a retracted neck at 7 dpi (day of euthanasia). All the geese developed viremia with different degrees from 1 to maximum 10 dpi peaking at 2 and 3 dpi. The clinically affected goose reached the highest values of 105.5 TCID50/mL at 2 dpi, while all the others had lower titers. Therefore, it is unlikely, that free-ranging geese serve as WNV amplifying hosts in Germany, yet individual differences in susceptibility are present. In the oropharyngeal and cloacal swab samples, viral RNA was detected from 2 to 7 dpi but no viable virus. As all the infected geese seroconverted clearly within five days, geese can be used as potential sentinel animals for the monitoring of WNV circulation in a given area. WNV distribution in the examined tissues and the corresponding histopathological lesions were time-dependent. During early pathogenesis (3 dpi), the virus dominated in the spleen but could also be found in all examined organs (detected by RT-qPCR and virus titration), while histological lesions in the brain were only just emerging. In histopathology, no clear signs of encephalitis were visible before 6 dpi yet the lesions were continuously pronounced until 21 dpi (i.e., even after the clearance of viral antigens). In conclusion, this study provides insights into the tissue distribution of WNV and the developed histopathological lesions over time. In order to simulate the epidemiological situation for birds in Germany and to investigate the effects of pre-existing USUV antibodies on a subsequent severe WNV infection, a third study (manuscript 3) was conducted. Thereby, young geese were initially infected with a German USUV isolate. At the latest 16 dpi USUV, all geese seroconverted in the WNV IgG ELISA, capable of detecting all flavivirus-specific antibodies. One day later (17 days after the USUV infection), 15 geese were sequentially infected with the same WNV isolate as in manuscript 2. The sampling days and animal numbers were also the same as in the mono-infection to allow good comparability of the results. After the subsequent WNV infection, the viral loads in the blood, swabs and tissues of the geese were significantly lower than after the WNV mono-infection of the previous study (manuscript 2) and no viable virus could be detected. From all of the organs, the spleens were most frequently WNV RT-qPCR-positive (up to 10 dpi), and many were characterized by follicular hyperplasia. Interestingly, at 21 dpi, two brains were WNV RT-qPCR-positive in contrast to only one after the WNV mono-infection. This corresponds to the diverse set of histopathological lesions found in the brains of the individual geese, not depending on the time point of examination. Furthermore, neither encephalomalacia, necrotic myocarditis nor lesions of a systemic vasculitis were detected in the WNV infected geese after USUV infection unlike in the WNV mono-infected geese (manuscript 2). After the previous USUV infection most tested geese had USUV copies and viable virus in their blood samples peaking at 2 dpi. Also, most oropharyngeal, and cloacal swabs were RT-qPCR-positive peaking at 4 and 5 dpi, respectively. Moreover, 10 dpi USUV, most sera of the USUV mono-infected geese were positive in the USUV virus neutralization test. One week later (still before the WNV infection), many of the sera were even cross-reactive against WNV. This cross-reaction appears to be advantageous for the birds, resulting in a partial immunity to further flavivirus infections of the same serogroup. After the subsequent WNV infection, the titers of the USUV neutralizing antibodies increased first, and one day later also those of the WNV neutralizing antibodies. The pathogenesis of the USUV infection was investigated at 7 and 37 dpi, when three USUV mono-infected geese were euthanized and examined, respectively. USUV copies were only found in the geese euthanized 7 dpi and in all organs of at least one of the three individuals (except for the bursa fabricii). Therefore, the geese were not only susceptible to an USUV infection but also replicated the virus and developed corresponding lesions. Feather pulps cannot only be a possible source of direct viral transmission, but they may also be a suitable diagnostic material to detect WNV or USUV in a less invasive manner. In summary, although geese are susceptible to WNV and USUV, they appear not to play a key role in the transmission cycle of both viruses. However, geese can be used as potential sentinel animals for the monitoring of USUV and WNV circulation in hot spot areas as well as in so far WNV free areas due to their quick and long-lasting antibody production. After the infection with USUV the geese produced antibodies that also cross-neutralized WNV and they were protected from severe disease in a subsequent WNV infection.

German. Die beiden Flaviviren West-Nil-Virus (WNV) und Usutu-Virus (USUV) können in Vögeln und Menschen Erkrankungen verursachen und unter Umständen sogar zum Tod führen. Die beiden Viren zirkulieren in einem enzootischen Zyklus zwischen Vögeln als Amplifikationswirten und Stechmücken als Vektoren. Dabei können Stechmücken das Virus auch auf den Menschen übertragen. Säugetiere sind sogenannte Fehlwirte der Infektion, können jedoch auch klinisch erkranken und das Virus über Blut- und Organspenden weitergeben. Das USUV wurde erstmals im Jahr 2010 in Stechmücken in Deutschland und im Jahr 2011 in Vögeln nachgewiesen. Seit 2018 ist das USUV im ganzen Land verbreitet. Das WNV wurde ebenfalls im Jahr 2018 zum ersten Mal in (Ost-) Deutschland in toten Vögeln gefunden. Es ist daher anzunehmen, dass sich USUV und WNV seither die gleichen Wirte, Vektoren und Verbreitungsgebiete in Deutschland teilen. Deswegen wurden im Rahmen dieser Dissertation die Pathogenität dieser beiden in Deutschland vorkommenden Viren näher untersucht sowie ihre Pathogenese in Gänsen. In der ersten Studie (Manuskript 1) wurden verschiedene Zelllinien genutzt, um Wachstumskurven von den in Deutschland vorherrschenden WNV- und USUV-Isolaten zu erstellen. Diese wurden zum Vergleich noch mit anderen europäischen Isolaten durchgeführt. Als Zellen dienten eine Säugetier- (Vero B4), eine Vogel- (GN-R) und zwei Moskitozelllinien (C6/36 and CT). Dabei zeigte sich, dass sich die Wachstumskurven der unterschiedlichen Isolate sehr ähnelten. Generell hatten die WNV-Wachstumskurven einen etwas steileren Anstieg als die der USUV-Isolate. Dabei produzierten die Wirbeltierzellen, vor allem die Gänsezellen schnell hohe Virustiter, wodurch es zu einem Zellsterben und dementsprechend zu einem Titerabfall kam. Im Gegensatz dazu war auf den Insektenzellen ein langsamerer und stetiger Titeranstieg zu beobachten. Daraufhin wurden noch simultane Ko-Infektionen mit ausgewählten Viruskombinationen und jeweils derselben Konzentration oder einer geringeren Konzentration von WNV durchgeführt. Auch dabei hatte das WNV einen Wachstumsvorteil, höchstwahrscheinlich durch die schnellere Replikation. Es zeigte sich weiterhin, dass der WNV-Titer von der simultanen USUV-Infektion nicht beeinflusst wurde, sondern vom eingesetzten Anfangstiter abhing. Außerdem war sichtbar, dass diese viralen in-vitro Interaktionen nicht spezifisch für ein Isolat, sondern reproduzierbar waren. Um die Rolle von Wirtschaftsgeflügel in Freilandhaltung im WNV-Übertragungszyklus aufzuklären, wurden in der zweiten Studie (Manuskript 2) experimentell 15 Junggänse mit einem WNV-Isolat der Linie 2 (Germany 2018) infiziert. Fast alle infizierten Gänse nahmen stetig an Gewicht zu und nur wenige zeigten unspezifische Symptome 5–10 Tage nach der Infektion (post infectionem [p.i.]), ohne Relevanz für den weiteren Versuch. Jedoch war eine Gans klinisch auffällig mit Gewichtsverlust (4 Tage p.i.) und einem steifen Gang (5–6 Tage p.i.), was sich zu apathischem Verhalten und einer Isolation von der Gruppe verschlechterte, weshalb das Tier am 7. Tag p.i. euthanasiert wurde. Alle Gänse entwickelten vom ersten bis zum (maximal) 10. Tag p.i. eine unterschiedlich stark ausgeprägte Virämie. Die klinisch auffällige Gans bildete den höchsten Virustiter mit 105.5 kulturinfektiöse Dosis 50 (KID50) /mL am 2.Tag p.i. aus, während alle anderen Tiere niedrigere Titer aufwiesen. Daher ist es unwahrscheinlich, dass Freilandgänse in Deutschland als Amplifikationswirte für WNV fungieren. Obwohl die infizierten Tiere von Tag 2 bis 7 p.i. virales WNV-Genom ausschieden, war jedoch in den Tupferproben kein vermehrungsfähiges Virus nachweisbar. Weiterhin serokonvertierten alle Gänse bereits spätestens am 5. Tag p.i., weswegen sie sehr gut als Sentineltiere für die WNV-Überwachung in einem Gebiet geeignet sind. Je nach Sektionszeitpunkt wurde WNV-Genom in allen untersuchten Gewebeproben bei mindestens einem Individuum mittels RT-qPCR nachgewiesen genauso wie histopathologische Läsionen. In der Anfangsphase (3 Tage p.i.) dominierte das WNV in der Milz, konnte jedoch mit RT-qPCR und Virustitration bereits in allen Organen nachgewiesen werden. In der Histopathologie wurden klare Zeichen einer Enzephalitis erst ab dem 6. Tag p.i. sichtbar. Jedoch wurden diese Läsionen auch noch an Tag 21 p.i. gesehen, wo kein Antigen mehr molekularbiologisch nachweisbar war. Damit konnte diese Studie gute Einblicke in den zeitlichen Verlauf der Verteilung von WNV in den unterschiedlichen Geweben sowie die pathologischen Läsionen geben. Um die epidemiologische Situation in Deutschland zu simulieren und zu überprüfen, ob schon vorhandene USUV-Antikörper Vögel vor einer schweren WNV-Infektion schützen können, wurde die dritte Studie (Manuskript 3) durchgeführt. Dafür wurden wiederum junge Gänse genutzt, die zunächst mit einem deutschen USUV-Isolat (Europa 3) infiziert wurden. Spätestens 16 Tage nach der USUV-Infektion serokonvertierten alle Tiere im WNV-IgG ELISA, der in der Lage ist, alle flavivirus-spezifischen Antikörper zu detektieren. Einen Tag später (17 Tage nach der USUV-Infektion) wurden dann 15 Gänse nachfolgend mit dem deutschen WNV-Isolat inokuliert. Dieses Isolat und auch das Beprobungsschema entsprachen dem der WNV-Mono-Infektion aus dem zweiten Manuskript, um eine gute Vergleichbarkeit der Ergebnisse zu erzielen. Nach der anschließenden WNV-Infektion waren die Viruslasten im Blut, in den Tupfern und in den Organen der Tiere signifikant niedriger als nach der WNV-Mono-Infektion aus der vorherigen Studie (Manuskript 2) und es wurde kein vermehrungsfähiges Virus in den Proben gefunden. Von allen Organen war die Milz am häufigsten positiv in der WNV-RT-qPCR (bis zu 10 Tage p.i.) und bei vielen Tieren durch eine follikuläre Hyperplasie gekennzeichnet. Interessanterweise waren am 21. Tag p.i. die Gehirne von zwei Gänsen positiv in der WNV-RT-qPCR im Gegensatz zu nur einer Gans nach der WNV-Mono-Infektion der zweiten Studie. Dies entspricht auch den Beobachtungen der Histopathologie der Gehirne, die eher Unterschiede zwischen den zeitgleich untersuchten Individuen aufzeigte als zwischen den verschiedenen Sektionszeitpunkten. Nach der vorherigen USUV-Infektion hatte ein Großteil der getesteten Gänse USUV-Genomkopien und vermehrungsfähiges Virus im Blut mit einem Höchstwert am 2. Tag p.i. Außerdem waren die meisten Rachen- und Kloakentupfer positiv mit jeweiligen Höchstwerten am 4. Tag, beziehungsweise 5. Tag p.i. Weiterhin waren 10 Tage p.i. die meisten Seren der USUV mono-infizierten Tiere positiv im USUV-Serumneutralisationstest. Eine Woche später (weiterhin noch vor der WNV-Infektion) waren viele der Seren sogar kreuzreaktiv gegen WNV. Diese Kreuzreaktion ist scheinbar hilfreich für die Gänse, weil sie zu einer Immunität gegen weitere Flavivirus-Infektionen derselben Serogruppe führt. Nach der zusätzlichen WNV-Infektion stiegen erst die Titer der USUV neutralisierenden Antikörper und einen Tag später auch die der WNV neutralisierenden Antikörper an. Die Pathogenese der USUV mono-infizierten Gänse wurde nur an den Tagen 7 und 37 p.i. betrachtet. An diesen Tagen wurden jeweils drei USUV mono-infizierte Gänse euthanasiert und untersucht. Dabei wurden USUV-Genome nur am 7. Tag p.i., dafür jedoch in allen untersuchten Gewebeproben (außer der Bursa fabricii) bei mindestens einem Individuum nachgewiesen. Damit lässt sich schlussfolgern, dass die Gänse nicht nur für das USUV empfänglich waren, sondern es auch replizierten und entsprechende Läsionen zeigten. Die nachgewiesene Viruslast in den Federpulpen kann nicht nur eine mögliche Quelle für eine direkte Virusübertragung darstellen, sondern Federn können auch ein geeignetes Material sein, um WNV oder USUV auf weniger invasive Weise im Tier nachzuweisen. Zusammenfassend zeigen die Untersuchungen, dass Gänse zwar für WNV- und USUV- Infektionen empfänglich sind, jedoch keine wichtige Rolle im Übertragungszyklus dieser beiden Viren spielen. Gänse können jedoch aufgrund ihrer schnellen und langanhaltenden Antikörperproduktion als potentielle Sentineltiere für die Überwachung der WNV- und USUV-Zirkulation in Hot-Spot-Gebieten wie auch in bisher virusfreien Regionen eingesetzt werden. Nach der USUV-Infektion produzierten die Gänse Antikörper, die auch WNV kreuz-neutralisierten. Daher schützte eine vorab erfolgte USUV-Infektion diese Vögel vor einer schweren Erkrankung bei einer nachfolgenden WNV-Infektion.