In vivo characterization of present and potentially pre-pandemic viruses — The SARS-CoV-2 and bat influenza H9N2 examples | In vivo Charakterisierung aktueller und potentiell prä-pandemischer Viren - Am Beispiel von SARS-CoV-2 und dem Fledermaus-Influenza A Virus H9N2

English. As the animal-to-human interface becomes increasingly narrow, transmission events of zoonotic pathogens between animals and humans become more and more probable. While SARS-CoV-2 already accomplished a spillover infection to humans and is responsible for the current pandemic, the bat H9N2 IAV with so far unknown zoonotic potential was only recently discovered. In order to identify I) the role and potential of a newly discovered, potentially pre-pandemic virus, such as the bat H9N2, or II) possible future prevailing virus mutant variants of an already known pandemic virus, such as SARS-CoV-2, it is important to characterize these emerging viruses in vivo as soon and as good as possible. The first objective in this dissertation (Publications I and II) therefore deals with the characterization of bat H9N2 and the estimation of its zoonotic or even pandemic potential. In Publication I, a general susceptibility of directly inoculated Egyptian fruit bats to bat H9N2 was confirmed by successful seroconversion, although exhibiting only moderate viral shedding. All three contact animals remained seronegative, though one contact bat showed slight lesions in the histopathological analysis. Publication II further addressed the question of the zoonotic potential of this virus. Inoculation of day-old turkey hatchlings demonstrated moderate susceptibility to bat H9N2 infection with a measurable seroconversion, while day-old chicken hatchlings were not susceptible to bat H9N2. Ferrets proved to be highly susceptible to bat H9N2 with high viral shedding, a transmission efficiency rate of 100% to direct contact animals at 2 days post contact, but with only minimal clinical signs. Importantly, the virus demonstrated the ability to evade the MxA-restriction factor and to replicate efficiently in human lung tissue explants. Furthermore, seasonal IAV- and standard IAV-vaccines showed no cross reactivity against the bat-N2 protein in humans. Therefore, further research on such viruses is urgently needed in order to prevent a renewed pandemic situation in the future as caused by SARS-CoV-2. The second objective in this dissertation dealt with the identification and characterization of emerging SARS-CoV-2 Variants of Concern (VOCs). Therefore, in Publication III, competitive infection experiments were performed using the Syrian golden hamster, the ferret, and transgenic mouse models (K18-hACE2 and hACE2-KI). These studies revealed replicative and transmissive predominance of Alpha VOC over Beta VOC, but not over SARS-CoV-2 WT in the hamster model, although Beta VOC substantially replicated in the lungs of donor animals. In contrast, the Alpha VOC had an unambiguous replication and transmission advantage over WT SARS-CoV-2 in the ferret and both mouse models. A recombinant SARS-CoV-2 WT-SAlpha virus helped to assign the fitness advantage of this variant particularly to the spike protein-associated mutations. In Publication IV, in vitro results inferred an early replicative fitness advantage of Omicron BA.1 over Delta VOC, although the opposite was observed in competitively inoculated hamsters, ferrets and naive hACE2-KI mice. In addition, Publication IV demonstrated a disadvantage in transmission for the VOC Omicron BA.1 over the Delta VOC and a lack of susceptibility of ferrets after a single infection with the VOC Omicron BA.1. An mRNA vaccination of K18-hACE2 mice caused a drastic reduction of infectious virus particles in organ material following an infection with a recombinant SARS-CoV-2 WT-SDelta, but not when challenged with the SARS-CoV-2 SOmicron BA.1 clone. This dissertation includes numerous, comprehensive experimental studies that are generally important for the characterization of emerging, potentially pre-pandemic viruses and may provide crucial information about the future dominance of certain virus variants in an ongoing pandemic. Here, the need for the use of a variety of animal models becomes apparent. By characterizing and classifying potentially zoonotic strains, these methods will help to better prepare for potentially upcoming pandemics and, in the case of a zoonotic or even pandemic event, to better detect and understand the circulating strains and their evolution.

German. Da die Schnittstelle zwischen Menschen und Tieren immer enger wird, ist in der Folge die Übertragungswahrscheinlichkeit eines Erregers von Tier zu Mensch unter Umständen deutlich erhöht. Während SARS-CoV-2 bereits erfolgreich eine Übertragung auf den Menschen realisierte und dadurch verantwortlich für die aktuelle Pandemie ist, wurde das Fledertier-assoziierte H9N2 IAV (bat H9N2) mit aktuell unbekanntem, zoonotischem Potential neu entdeckt. Um nun I) die Rolle und das Potential eines neuen, eventuell prä-pandemischen Virus‘, wie des bat H9N2, oder II) zukünftig vorherrschende Virusvarianten eines bereits bekannten, pandemischen Virus‘, wie z.B. des SARS-CoV-2, zu identifizieren, ist es nötig, diese Viren so schnell und gut wie möglich auch in vivo zu charakterisieren Die erste Fragestellung dieser Dissertation (Publikationen I und II) befasst sich daher mit der Charakterisierung des bat H9N2 und die Abschätzung seines pandemischen Potentials. In Publikation I wurde eine generelle Empfänglichkeit der inokulierten Nilflughunde als natürlicher Wirt für bat H9N2 über die erfolgte Serokonversion bestätigt, obwohl die Tiere nur moderate Viruslasten ausschieden. Alle drei Kontakttiere blieben allerdings seronegativ, obwohl ein Kontakttier leichte Läsionen in der histologischen Analyse zeigte. Publikation II befasste sich ebenfalls mit der Frage des zoonotischen Potentials dieses Virus. Die Inokulation von Eintags-Putenküken bewies eine moderate Empfänglichkeit mit messbarer Serokonversion dieser Tiere, während Eintags-Hühnerküken nicht für bat H9N2 empfänglich waren. Frettchen erwiesen sich als sehr gut mit bat H9N2 infizierbar, mit einer sehr hohen Virusausscheidung, einer effizienten Transmissionsrate von 100% zu direkten Kontakttieren an Tag 2 nach Erstkontakt, aber nur minimaler Klinik. Das Virus bewies ebenso die Fähigkeit dem MxA-Restriktionsfaktor auszuweichen und in humanen Lungengewebsexplanaten effizient zu replizieren. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass saisonale IAV und die Standard IAV-Vakzinen keine Kreuzreaktivität gegen das N2-Protein des bat H9N2 Virus im Menschen induzieren. Daher ist eine weitergehende Erforschung solcher Viren dringend notwendig, um zukünftig eine erneute pandemische Situation wie durch SARS-CoV-2 hervorgerufen, zu verhindern. Die zweite Fragestellung dieser Dissertation beschäftigt sich mit der Identifikation und Charakterisierung von neu auftretenden SARS-CoV-2 Variants of Concern (VOCs). In Publikation III wurden daher kompetitive Infektionsversuche mit dem syrischen Goldhamster, dem Frettchen, sowie transgenen Mausmodellen (K18-hACE2 und hACE2-KI) durchgeführt. Diese Studien konnten einen deutlichen, replikativen und transmissiven Vorteil der VOC Alpha über VOC Beta, nicht aber gegenüber dem WT SARS-CoV-2 im Hamstermodell darlegen, obwohl VOC Beta substantiell in der Lunge von Donor-Tieren replizierte. Im Gegensatz hierzu erwies sich die Replikation und Transmission der VOC Alpha als deutlich im Vorteil gegenüber WT SARS-CoV-2 im Frettchen und in beiden Mausmodellen. Ein rekombinantes SARS-CoV-2 WT-SAlpha Virus half, den Fitnessvorteil dieser Variante besonders den Spike-Protein-assoziierten Mutationen zuzuordnen. In Publikation IV zeigten in vitro Ergebnisse einen frühen, replikativen Vorteil der VOC Omikron BA.1 gegenüber der VOC Delta, obwohl im kompetitiv inokulierten Hamster-, Frettchen- und naivem K18-hACE2-Mausmodell stets ein Vorteil der VOC Delta beobachtet werden konnte. Außerdem wurde in Publikation IV ein transmissiver Nachteil der VOC Omikron BA.1 gegenüber VOC Delta und eine fehlende Empfänglichkeit des Frettchens nach einer Einzelinfektion mit der VOC Omikron BA.1 nachgewiesen. Eine mRNA-Vakzinierung bewirkte eine drastische Reduktion infektiöser Viruspartikel in Organmaterial von K18-hACE2 Mäusen in Folge einer Belastungsinfektion mit einem rekombinanten SARS-CoV-2 WT-SDelta Virus, nicht jedoch in Folge einer SARS-CoV-2 WT-SOmikron BA.1Infektion. Diese Dissertation umfasst zahlreiche, detaillierte experimentelle Studien, die einerseits generell für die Charakterisierung von neu auftretenden, möglicherweise prä-pandemischen Viren von Bedeutung sind, andererseits aber auch entscheidende Hinweise über die zukünftige Dominanz bestimmter Virusvarianten in einer laufenden Pandemie liefern können. Hierbei wird die Notwendigkeit der Verwendung von unterschiedlichen Tiermodellen deutlich. Diese Methoden werden durch die Charakterisierung und Klassifizierung möglicherweise zoonotischer Virusstämme dabei helfen, sich besser auf bevorstehende potentielle Pandemien vorzubereiten und im Falle eines zoonotischen oder gar pandemischen Geschehens die zirkulierenden Stämme und deren Evolution besser zu erfassen und zu verstehen.