Impact of tRNA modifications and translation control for pathogenicity and host responses upon influenza A virus infection | Impacto das modificações do ARN transferência para a patogenicidade e respostas do hospedeiro após infeção pelo vírus influenza A

Viruses rely heavily on the host cell translation machinery, including host transfer RNAs (tRNAs), to efficiently translate their genomes. However, many viral RNA genomes, including the influenza A virus (IAV), are enriched in codons ending in adenine (A) or uridine (U), whereas the human genome is rich in cytosine (C) or guanine (G) ending codons. This is a challenge for viruses, as they require decoding of sub-optimal codons for which cognate host tRNAs are underrepresented. Nevertheless, despite the codon usage differences, codon-biased translation of IAV genes is highly efficient, suggesting the existence of viral strategies to manipulate host tRNA populations for optimal viral protein production. The reprogramming of host cell tRNA modifications upon infection may be one such strategy. tRNAs harbor a plethora of chemical modifications, collectively known as the tRNA epitranscriptome. These modifications are catalyzed by different classes of tRNA-modifying enzymes and, when they occur in the anticodon loop region, ensure the efficiency and fidelity of the translation process. These epitranscriptomic marks exhibit a dynamic behavior across cells and tissues, changing rapidly in response to environmental cues to maximize translation of stress-response genes. Given that viruses are sources of host cellular stress, it is possible that modulation of the hosts’ tRNA epitranscriptome occurs in this context. In this dissertation, I set to explore if and how host cell tRNA modifications were remodeled in a single cycle of IAV infection. The obtained results demonstrate that IAV infection affects the levels of mcm5U34 and mcm5s2U34 and of cognate tRNA modifying enzymes, including the elongator acetyltransferase complex subunit 3 (ELP3). To evaluate the relevance of ELP3 and its dependent modifications in the context of IAV infection, knockdown experiments were conducted. Loss of ELP3 induced tRNA hypomodifications and impaired translation of codon biased IAV genes. Moreover, the ELP3 knockdown triggered the integrated stress response (ISR) and interfered with the unfolded protein response (UPR)-related mechanisms, pivotal for IAV propagation. Specifically, silencing of ELP3 prior to IAV infection intensified the phosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2 (eIF2α) and inhibited the inositol-requiring enzyme 1 α (IRE1α) axis concomitant to the accumulation of protein aggregates in the endoplasmic reticulum (ER) lumen of host-infected cells. Ultimately, induction of eIF2α likely amplified host antiviral responses linked to the NF-kB pathway, promoting the expression of interferon beta (IFN-β) and IFN regulatory factor 1 (IRF1). Taken together, our results uncover the relevance of the host cell tRNA epitranscriptome for optimal expression of viral genomes and host antiviral responses, setting the tRNA epitranscriptome as a promising host-based antiviral target.

Os vírus dependem da maquinaria de tradução da célula hospedeira, incluindo os tRNAs, para conseguir traduzir eficientemente o seu genoma. Contudo, a maioria dos genomas de vírus de ARN, incluindo do vírus da influenza A (IAV), são ricos em codões que terminam em adenina (A) ou uridina (U), enquanto o genoma humano é predominantemente composto por codões que terminam em citosina (C) ou guanina (G). Tal representa um desafio para os vírus, uma vez que a descodificação dos seus codões requer moléculas de tRNA que existem em menor proporção em células hospedeiras. Apesar disso, a tradução dos genes do IAV é altamente eficiente, sugerindo que o vírus poderá ter desenvolvido estratégias para manipular as populações de tRNA do hospedeiro e maximizar a produção de proteínas virais. A reprogramação das modificações nas moléculas de tRNA durante a infeção viral poderá constituir uma dessas estratégias. As moléculas de tRNA possuem uma vasta variedade de modificações químicas, coletivamente designadas como epitranscriptoma do tRNA. Estas modificações, catalisadas por diferentes classes de enzimas modificadoras de tRNA, quando se localizam na região do anticodão, garantem a eficiência e fidelidade do processo de tradução. Vários estudos têm vindo a demonstrar que tais modificações exibem um comportamento dinâmico em células e tecidos, alterando-se rapidamente em resposta a diferentes estímulos ambientais no sentido de otimizar a tradução de genes de resposta ao stress celular. Tendo em conta que vírus são considerados fontes de stress celular para o hospedeiro, é possível que alterações ao nível do epitranscriptoma de tRNA da célula hospedeira ocorram para reprogramar a otimização de codões. Nesta dissertação, propus-me a explorar se e como as modificações de tRNA da célula hospedeira são remodeladas num único ciclo de infeção por IAV. Os resultados obtidos demonstram que a infeção por IAV impacta os níveis das modificações mcm5U34 e mcm5s2U34 e de várias enzimas modificadoras de tRNA envolvidas na sua formação, especialmente a proteína 3 do complexo elongador (ELP3). Para avaliar a relevância da ELP3 e das suas modificações no contexto da infeção por IAV, foram realizadas experiências de supressão genética. O silenciamento da ELP3 induziu hipomodificações nas moléculas de tRNA e uma redução dos níveis de tradução dos genes do IAV. Estes resultados demonstram ainda que a supressão da ELP3 desencadeia a resposta integrada ao stress e interfere com os mecanismos relacionados com a resposta a proteínas mal enoveladas (UPR), essenciais para a propagação do IAV. Especificamente, o silenciamento da ELP3, previamente à infeção por IAV, intensifica a fosforilação da subunidade 1 do fator de tradução eucariótica 2 (eIF2α) e inibe as respostas associadas ao eixo da inositol-requiring enzyme 1 α (IRE1α) da UPR, concomitantemente à acumulação de agregados proteicos no lúmen do reticulo endoplasmático (RE) das células hospedeiras. Em última instância, a indução da fosforilação do eIF2α amplifica a resposta antiviral do hospedeiro associada à via de sinalização do fator nuclear kappa B (NF-κB), promovendo a expressão de interferão beta (IFN-β) e do fator regulador do IFN 1 (IRF1). De um modo geral, os resultados obtidos com esta tese comprovam a relevância do epitranscriptoma de tRNA da célula hospedeira na otimização da tradução de genomas virais e respostas antivirais do hospedeiro. Estas descobertas evidenciam que o epitranscriptoma do tRNA é um promissor alvo terapêutico antiviral centrado no hospedeiro, abrindo caminho para o desenvolvimento de novas terapias antivirais inovadoras.

Programa Doutoral em Biomedicina