Nuclear envelope dysfunctions observed in patients with myotonic dystrophy type 1 | Disfunções do envelope nuclear observadas em doentes com distrofia miotónica tipo 1

Muscular dystrophies are a very heterogeneous group of inherited diseases that are characterized by muscle weakness, loss of muscle mass and, in some cases, alterations in nervous system. To date, more than 30 different forms of muscular dystrophies are known, including myotonic dystrophy (DM). Myotonic dystrophy has two distinct variants, myotonic dystrophy type 1 (DM1) and myotonic dystrophy type 2 (DM2), which result from an abnormal expansion of the CTG trinucleotide and CCTG tetranucleotide, respectively. DM1 results from an abnormal expansion of CTG in the 3 'untranslated region of the DMPK gene. The mutant DMPK mRNA accumulates in the nucleus as ribonuclear foci compromising the normal nuclear function. In recent years, nuclear envelope (NE) proteins have been associated with muscular dystrophies and specifically with DM1, as being an essential component in the response of cells to external mechanical stresses and in maintaining the integrity of muscle cells. To date, only few studies have shown that fibroblasts and myoblasts/myotubes from patients with DM1 have a compromised nuclear structure, together with altered location and intracellular levels of some NE proteins. Despite this, the role of NE proteins in DM1 is remain unclear and further studies are needed. Therefore, in present work, we analysed fibroblasts from an apparently healthy control and from patients with DM1 with approximately 1000 and 2000 CTG repeat length (representing the adult and congenital phenotypes, respectively) using the techniques western blotting and immunocytochemistry to evaluate NE protein levels and subcellular localization, respectively. Concerning intracellular levels of NE proteins, we observed an increase in LAP1, SUN1, lamin A/C and lamin B1 intracellular levels, in patients with DM1 when compared with controls. In the case of nesprin-1, a decrease in the intracellular was observed. The intracellular levels of nesprin-2 were decreased only with DM1_2000 fibroblasts when compared with controls. Finally, the emerin proteins levels were similar between the DM1-derived fibroblasts and controls. In the study of immunocytochemistry, we found that the nuclei of DM1-derived fibroblasts, when marked only with DAPI, presented an increase in deformed nuclei, accompanied by a significant increase in nuclear area (DM1_2000). In addition, we found that the nuclei of DM1-derived fibroblasts, positive for lamin A/C proteins. emerin, LAP1 and nesprin-1 showed also an increase in the number of deformed nuclei and nuclear inclusions. In the case of the lamin A/C, emerin and LAP1, there was also an increase in the immunolabelling of the NE and the nucleoplasm. In summary, we demonstrated that DM1 patients tend to have changes in the intracellular levels of NE proteins and that these are accompanied by changes in the nuclear architecture. Thus, further studies are needed to elucidate the contribution of this structure to the pathological mechanisms of DM1.

As distrofias musculares são um grupo muito heterogêneo de doenças hereditárias que se caracterizam por fraqueza muscular, perda de massa muscular e, em alguns casos, alterações do sistema nervoso. Até o momento, são conhecidas mais de 30 formas diferentes de distrofias musculares, incluindo distrofia miotónica (DM). A distrofia miotónica possui duas variantes distintas, distrofia miotónica tipo 1 (DM1) e distrofia miotónica tipo 2 (DM2), que resultam de uma expansão anormal do trinucleótido CTG e do tetranucleótido CCTG, respetivamente. O DM1 resulta de uma expansão anormal de CTG na região 3 'não traduzida do gene DMPK. O mRNA DMPK mutante acumula-se no núcleo como focos ribonucleares comprometendo a função nuclear normal. Nos últimos anos, as proteínas do envelope nuclear (NE) têm sido associadas às distrofias musculares e, especificamente, á DM1, sendo um componente essencial na resposta das células a stresses mecânicos externos e na manutenção da integridade das células musculares. Até ao momento, poucos estudos demonstraram que fibroblastos e mioblastos / miotubos de pacientes com DM1 têm estrutura nuclear comprometida, juntamente com localização e níveis intracelulares alterados de algumas proteínas NE. Apesar disso, o papel das proteínas NE no DM1 ainda não está claro e mais estudos são necessários. Portanto, no presente trabalho, analisamos fibroblastos de um controle aparentemente saudável e de pacientes com DM1 com aproximadamente 1000 e 2000 repetições de CTG (representando os fenótipos adulto e congénito, respetivamente) usando as técnicas de western blotting e imunocitoquímica para avaliar os níveis de proteína NE e localização subcelular, respetivamente. Em relação aos níveis intracelulares das proteínas NE, observamos aumento nos níveis intracelulares de LAP1, SUN1, lamina A / C e lamina B1, em pacientes com DM1 quando comparados aos controles. No caso da nesprina-1, foi observada uma diminuição dos níveis intracelulares da proteína. Os níveis intracelulares de nesprina-2 diminuíram apenas em fibroblastos de DM1_2000 quando comparados aos controles. Finalmente, os níveis da proteína emerina foram semelhantes entre os fibroblastos derivados de DM1 e controles. No estudo da imunocitoquímica, constatamos que os núcleos dos fibroblastos derivados do DM1, quando marcados apenas com DAPI, apresentavam aumento de núcleos deformados, acompanhado de aumento significativo da área nuclear (em DM1_2000). Além disso, descobrimos que os núcleos de fibroblastos derivados de DM1 são positivos para proteínas da lâmina A/C. emerina, LAP1 e nesprina-1 também apresentaram aumento no número de núcleos deformados e inclusões nucleares. No caso da lâmina A/C, emerin e LAP1, também houve aumento da imunomarcação do NE e do nucleoplasma. Em resumo, demonstramos que pacientes com DM1 tendem a apresentar alterações nos níveis intracelulares das proteínas NE e que estas são acompanhadas por alterações na arquitetura nuclear. Assim, mais estudos são necessários para elucidar a contribuição dessa estrutura para os mecanismos patológicos do DM1.

Mestrado em Biomedicina Molecular