Perigos microbiológicos em alheira: principais vias de contaminação por Staphylococcus aureus, Clostridium perfringens e Salmonella spp

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias

A salsicharia tradicional transmontana é extremamente diversificada, associada a múltiplos factores como são as variações da formulação. Existem produtos que incluem pão na sua formulação entre os quais se destaca a alheira pela popularidade alcançada junto do consumidor e importância económica que representa para o pequeno produtor doméstico e muitas indústrias da região. Refira-se contudo a escassez de conhecimentos que existe relativamente às características deste produto particularmente quando produzido a nível industrial. Os ensaios realizados no presente trabalho visaram contribuir para o conhecimento de alguns aspectos da microbiologia da “alheira” produzida a nível industrial, identificando de entre vários microrganismos causadores de toxi-infecção, os mais prevalentes; avaliar a origem e vias mais prováveis utilizadas por estes microrganismos na contaminação de alheira; avaliar a diversidade genética das populações microbianas em estudo. Foi transversalmente estudada a influência da origem das amostras considerando a diversidade relativa a locais na linha de fabrico e/ou indústria de proveniência. Para cumprir esses objectivos o trabalho experimental foi delineado em três capítulos. No primeiro capítulo do trabalho experimental procedeu-se à quantificação de grupos microbiológicos representativos da flora deteriorativa assim como pesquisa de microrganismos patogénicos referidos como causadores de toxi-infecção alimentar. Comprovou-se na amostragem efectuada, consistindo em amostras provenientes de quatro indústrias e seis lotes de produção, que a alheira se trata de um produto que apresenta teores microbianos elevados, existindo por vezes indicadores de deficiente qualidade microbiológica. Em 70% das amostras analisadas foi isolado pelo menos um microrganismo patogénico. De entre os microrganismos causadores de toxi-infecção pesquisados os mais prevalentes foram S. aureus, C. perfringens e Salmonella spp. presentes respectivamente em 50%, 25% e 12,5% das amostras, apresentando em algumas amostras, teores referidos como capazes de causar toxi-infecção alimentar. Os resultados demonstraram que a indústria de proveniência das amostras foi um factor determinante nas características microbiológicas apresentadas pelo produto e no valor de ocorrência dos microrganismos patogénicos mais prevalentes; os produtos provenientes de indústrias de maior dimensão, apresentaram teores microbianos significativamente superiores e um número significativamente maior de amostras contaminadas por S. aureus, C. perfringens e Salmonella spp. No segundo capítulo do trabalho experimental avaliaram-se eventuais particularidades da tecnologia de fabrico e das linhas de fabrico monitorizadas, e procedeu-se ao estudo da ocorrência de S. aureus, C. perfringens e Salmonella spp.em vários pontos da linha das quatro linhas de fabrico de alheira monitorizando quatro lotes de produção. Da análise dos valores de ocorrência dos microrganismos em vários pontos na linha de fabrico da alheira concluiu-se que, a ocorrência de S. aureus parece estar particularmente associada à ocorrência deste microrganismo no produto em fases precoces de fabrico como a carne cozida e desfiada, e massa da alheira, que podemos relacionar com a operação de manipulação; e na tripa utilizada para o enchimento. A ocorrência de C. perfringens parece ser determinada pela ocorrência do microrganismo nas tripas utilizadas no seu enchimento e especiarias. Também em relação a Salmonella spp., a utilização de tripas contaminadas parece ser determinante na ocorrência deste microrganismo na alheira. De forma geral, os resultados da ocorrência destes microrganismos em vários pontos nas diferentes linhas de fabrico, foram indicativos da existência de diferenças significativas no padrão de contaminação apresentado, o que implica que a eventual planificação de medidas de controlo deverá adequar-se a cada linha de fabrico em particular, colocando-se as devidas reservas a qualquer hipótese de generalização. Verificou-se contudo, uma tendência para a homogeneidade no tipo de contaminação observada em cada linha de fabrico, observando-se um padrão de contaminação, o que facilitará uma posterior definição de estratégias de controlo destes microrganismos nas linhas de fabrico estudadas. No terceiro capítulo do trabalho experimental foram aplicados métodos de tipificação baseados em PCR a isolados bacterianos de Staphylococcus aureus e Salmonella spp., obtidos em vários pontos das linhas de fabrico da alheira. As metodologias utilizadas foram a Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) e Repetitive Element PCR (rep-PCR) dado tratarem-se de métodos de relativa facilidade de execução e interpretação e por isso de possível aplicabilidade no futuro a nível do tecido empresarial. A obtenção de informações relativas a fontes e vias de contaminação utilizadas por estas bactérias na contaminação da alheira e avaliação da diversidade genética dos isolados foram os objectivos deste trabalho. Os resultados obtidos confirmaram e complementaram os resultados obtidos do estudo de ocorrência destes microrganismos. Os resultados foram indicativos de que a presença S. aureus na alheira pode resultar de diferentes origens e utilizar diferentes vias de contaminação. A contaminação de alheira por S. aureus pode resultar quer de contaminações cruzadas com origem na utilização de matériasprimas contaminadas (carnes, pão ou tripas), na qual o manipulador parece ter um papel importante como veículo, quer directamente por intermédio de tripas contaminadas. Os resultados são também indicativos da possibilidade dos manipuladores poderem representar a fonte primária deste microrganismo. Na tipificação molecular de Salmonella spp. confirma-se que a presença deste microrganismo no produto final é resultante da utilização de tripas contaminadas. Esta contaminação ocorre directamente ou por contaminação secundária devido ao contacto com superfícies contaminadas. Para ambos os microrganismos foi possível verificar a coexistência de diferentes vias de contaminação no fabrico de alheira. Destaca-se ainda a diversidade genética apresentada pelos isolados de S. aureus e Salmonella spp obtidos nas linhas de fabrico das quatro indústrias monitorizadas, verificando-se que o padrão genético apresentado não foi um acontecimento independente da origem dos isolados tanto da indústria de proveniência como do local de isolamento na linha de fabrico. Face aos resultados obtidos no presente trabalho, em função da amostragem efectuada, pode concluir-se que os produtos provenientes das indústrias monitorizadas, podem apresentar problemas em termos de qualidade e segurança microbiológica, revelados pelos elevados teores microbianos apresentados e valores de ocorrência em microrganismos patogénicos, que urge resolver. Face aos objectivos do trabalho verificou-se que a aplicação das metodologias de tipificação baseadas em PCR ensaiadas, originaram informação valida e variada para inferir acerca das vias de contaminação utilizadas pelos microrganismos estudados na linha de fabrico da alheira.

There is a great diversity of traditional sausages in Trás-os-Montes, depending on several factors, such as differences in recipe. There are products which include bread in their recipe. Amongst these, the “alheira” is important because of its popularity with the consumer, and because its economic importance for small domestic producers and for many factories in the region. Surprisingly, there is little information about the characteristics of the “alheira”, particularly concerning industrial production. The tests performed in the current work aimed to clarify some aspects of the microbiology of industrially produced alheiras, identifying, among the several foodborne disease-causing microorganisms, the most prevalent ones; to evaluate the origin of these microorganisms and most probably means contamination in “alheiras”; to evaluate the genetic diversity of the studied microbe populations. The influence of the origin of the sample, considering each stage on the production line and/or the original factory were studied. In order to accomplish these objectives, the experimental work was outlined in three chapters. In the first chapter of the experimental work a microbiological groups count representing the deteriorative microflora, was carried out as well as a search for pathogenic microorganisms responsible for foodborne disease. It was shown, in the sampling that took place, consisting of samples proceeding from four factories and from six different production batches, that the “alheira” is a product which presents high microbic values, with the existence of indicators of deficient microbiological quality. In 70% of the analysed samples, at least one pathogenic microorganism was isolated. Among the toxi-infection-causing microorganisms being searched for, the most prevalent were S. aureus, C. perfringens and Salmonella spp. present respectively in 50%, 25% and in 12.5% of the samples. In some samples, the values found are known to be capable of causing foodborne disease. Results showed that the factory where the samples were collected was a determinant factor in the microbiological characteristics shown by the product, and in the occurrence of the most prevalent pathogenic microorganisms. Products from bigger factories showed significantly superior microbian values, and a significantly greater number of samples contaminated by S. aureus, C. perfringens and by Salmonella spp. In the second chapter of the experimental work possible singularities in the production technology and of the monitored production lines were evaluated, and the occurrence of S.aureus, C. perfringens and Salmonella spp. was studied in several stages along each one of the four alheira production lines, by monitoring four production batches. From the analysis of the occurrence values of the microoganism in several stages of the “alheira” production line, it was concluded that the occurrence of S. aureus seems to be particularly associated with the occurrence of this microorganism in the product in early fabrication stages, such as boiled and shredded meat, and the alheira filling, which can be related to the handling operation; and in the gut used for the stuffing. The occurrence of C. perfringens seems to be determined by the occurrence of the microorganism in the gut used for the stuffing and in seasoning. Also in relation to Salmonella spp., the use of contaminated gut seems to be determinant in the occurrence of this microorganism in “alheiras”. In general, the results of the occurrence of these microorganisms in several stages of the different production lines, showed the existence of significant differences in the contamination pattern. In consequence, the eventual planning of control measures should be appropriate to each particular production line, with little possibility of generalization. However a tendency to homogeneity in the kind of contamination observed in each production line was verified, showing a contamination pattern. This might make it easier to establish a posterior control strategy for these microorganisms in the production fabrication lines in study. In the third chapter of the experimental work, PCR based typing methods were used on Staphylococcus aureus and Salmonella spp. bacteria isolates, obtained in several stages of the alheira production line. The used methodologies were Random Amplification of Polymorphic DNA (RAPD) and Repetitive Element PCR (rep-PCR), methods that are relatively easy to apply and to analyse, and therefore possible to apply in the future. The obtaining of information concerning sources and means of contamination used by these bacteria in the contamination of “alheiras”, and the evaluation of the genetic diversity of the isolates, were the main purposes of this work. The obtained results confirmed and complemented the results previously obtained in the study of the occurrence of these microorganisms. Results showed that the presence of S. aureus in “alheira” may result from different causes and different means of contamination. The contamination of “alheira” by S. aureus may result both from cross contamination, originating in the use of contaminated raw materials (meat, bread or gut), where the handler seems to have an important role as vehicle, and directly, from contaminated gut. The results also indicate the possibility that handlers may represent the primary source of this microorganism. In the molecular typing of Salmonella spp., it was confirmed that the presence of this microorganism in the final product results from the use of contaminated gut. This contamination occurs either directly or through secondary contamination, due to contact with contaminated surfaces. For both microorganisms it was possible to verify the coexistence of different means of contamination the production of “alheiras”. What is noteworthy is the genetic diversity showed by the isolates of S. aureus and Salmonella spp obtained in the production lines of the four monitored factories. It was verified that the genetic pattern revealed was not independent of the origin of the isolates: nor of the factory concerned nor of the isolate stage in the production line. In view of the results obtained in the present work, from the sampling carried out it might be concluded that products from the monitored industries may have problems of microbiological quality and safety, revealed by the high microbe levels shown and by the occurrence values of pathogenic microorganisms, which must be solved. In view of the objectives of the present work, it was verified that the application of the tested PCR based typing methodologies, yielded valid and varied information about the means of contamination used by the studied microorganisms in “alheira” production lines.