Application of FTIR spectroscopy as a clonal selection tool for the improvement of grape varieties: The Tinta Roriz case

Dissertação de Mestrado em Enologia e Viticultura apresentada à Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro

No presente trabalho, foram avaliados trinta clones distintos da casta Tinta Roriz / Tempranillo, da espécie Vitis vinífera L., que haviam sido posteriormente selecionados num trabalho de melhoramento desta casta, através de selecção clonal, levado a cabo pela PORVID, e posteriormente pela ADVID. Amostras de uvas correspondentes a videiras com os diferentes genótipos, foram colhidas em dois campos experimentais, situados na Região Demarcada do Douro (RDD), uma das mais antigas e mais relevantes a nível mundial, aquando da vindima para vinificação. As duas vinhas mencionadas situam-se na Quinta do Cavernelho (Cima Corgo), e Quinta de São Luiz (Baixo Corgo), de forma a avaliar o desempenho destes genótipos em duas sub-regiões distintas. Adicionalmente, os campos experimentais foram plantados com seis réplicas (de 5-6 videiras) de cada clone, seguindo uma distribuição latinizada, de forma a acomodar nos resultados a variabilidade decorrente de diferentes condições existentes dentro da mesma vinha. Das amostras de uvas recolhidas, (60 bagos por amostra) foram produzidos homogeneizados, retiradas películas, e alguns dos bagos foram liofilizados, de forma a realizar extracções para a avaliação dos conteúdos em fitoquímicos, e actividade antioxidante de cada clone. No que diz respeito aos homogeneizados, foram avaliados o °Brix, pH, e acidez titulável, ao passo que os extractos obtidos foram analisados tendo em vista os seus conteúdos em: flavonoides, fenóis totais, Ortho-difenóis, taninos e antocianinas, tendo a sua actividade antioxidante sido avaliada através de duas metodologias distintas, o ABTS, e DPPH, (ambas baseadas na avaliação da capacidade dos extractos para reduzir um radical estável. Concomitantemente, foram registados espectros de Infravermelho para os homogeneizados obtidos, e para películas de uva, com recurso a um instrumento FTIR-ATR, que permite a obtenção de espectros para este tipo de matrizes sem qualquer preparação das amostras. Estes espectros foram obtidos com o propósito de desenvolver uma metodologia para a avaliação dos diferentes clones somente através da aquisição do seu espectro, para vir, por exemplo a ser utilizada nas próximas campanhas deste programa de melhoramento varietal.Para esse efeito, foram testados diferentes tratamentos espectrais (subtracção de linha de base, selecção de intervalos, utilização de derivadas), de forma a obter vários conjuntos de dados para serem aplicados em métodos de análise multivariada. Para produzir os modelos de avaliação de conteúdos / discriminação, foi utilizado o método de regressão PLS (Partial Least Squares), e também o PLS-DA (PLS-Discriminant Analysis), para realizar classificações das amostras. Em ambos os casos foi utilizado um método de validação cruzada (CV), como método de validação. Verificou-se que existem grandes diferenças entre os diferentes campos experimentais, assim como diferenças assinaláveis entre réplicas dentro de cada campo. Assim, as amostras distinguem-se claramente, no que diz respeito à sua origem, mas não é possível associar amostras do mesmo clone plantado nos dois campos distintos. Os resultados espectroscópicos permitem também separar as amostras relativamente à sua origem, sendo também passíveis de ser utilizadas para a avaliação dos seus conteúdos, não o sendo, no entanto, para a discriminação directa entre clones, devido às suas diferenças intrínsecas já mencionadas.

Several grapevine varieties have been subjected to clonal selection, aiming to their improvement, to allow the availability of good quality vegetal materials, regarding specific traits. Thus, one of the most important grape varieties worldwide, Tempranillo, has been subjected to clonal selection, since the late 1970’, in an effort started by PORVID, aiming to the improvement of this variety, a work sustained in the last few years by ADVID, which manages two trial fields where 30 previously selected clones were installed. These trial fields, which were established in 2012, in commercial vineyards, are placed in the Douro Demarked Region (DDR), one of the oldest and more relevant geographical indications, located both in the sub-region Cima Corgo, a steep slope and low altitude, and in the sub-region of the Baixo Corgo, a flat area at high altitude. In the present work, these clones have been thoroughly assessed, respecting their traits of interest and biochemical contents. To study these clones, 60 grapes were collected from each sample, and both grape skins and homogenates have been evaluated. In a first stage, these materials were assessed respecting their analytical parameters and phytochemical contents, resorting to conventional standard and colorimetric methods. Furthermore, extracts from these materials were also assessed respecting antioxidant activity, through two distinct assays (DPPH and ABTS), which rely on the capacity of the extracts to reduce a stable radical. Concomitantly, spectroscopical means, namely FTIR, were used to develop a fast and simple methodology, resorting to multivariate statistical approaches, allowing the assessment of clones, solely by spectral acquisition. For this purpose, PLS (Partial Least Squares) regressions were used, as well as PLS-DA (PLS-Discriminant Analysis), while both grape homogenates and grape skins have been assessed. In a first stage, the best spectral treatments, as well as the optimal intervals, for these tasks have been evaluated (baseline subtraction, normalization, 1st derivative). The different data sets obtained from these treatments were subsequently assessed regarding their suitability to produce prediction models, either concerning the discrimination between the samples, or for the prediction of analytic parameters allowing the evaluation of the clones. The quality of the models retrieved was evaluated resorting to CV (Cross-Validation) procedures, and comparison between experimental and predicted values. Concerning the evaluation of the clones, it has been observed, that, since the differences arising between sites are greater that those due to the genotype, the comparison between clone performances must be undertaken for each site. Similar observations have been made regarding the use of spectroscopical data to discriminate the samples, showing that the scpectroscopical data actually reflects the samples’ contents. Moreover, spectroscopical data can be applied for the assessment of distinct analytical parameters of clones from the same grape variety, while different spectral treatments can be preferable for distinct parameters. Therefore, while the spectroscopical approaches do not allow to differentiate the distinct clones directly, due to their variability within a trial site, they do allow the prediction of analytical parameters, which could be applied in normal evaluation models, such as EBLUPS, to assist clone selection.