Mare endometrium fibrosis : epigenetics and novel fibrosis markers

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias na especialidade Ciências Biológicas e Biomédicas. Área científica de Morfologia e Função

ABSTRACT - Endometrosis is a major cause of infertility in mares and involves the excessive deposition of extracellular matrix (ECM) in the mare's endometrium, such as collagen type I (COL1), and type III (COL3). In fibrosis there is an imbalance between metalloproteinases (MMPs) and their tissue inhibitors (TIMPs), resulting in dysregulation between collagen degradation and deposition. Transforming growth factor β1 (TGF-β1) is one of the major pro fibrotic signals for myofibroblast differentiation, identified by the expression of α-smooth muscle actin (α-SMA), promoting collagen production. Alterations in fibroblast phenotype are associated with epigenetic alterations in chromatin structure. Epigenetic changes can be reversed and therefore extremely promising for therapeutic use. DNA methylation analysis is one of the most used methods to detect epigenetic changes. The aims of this study were to: (i) evaluate if COL1, COL3 and hydroxyproline could serve as possible blood biomarkers of equine endometrosis diagnosis and fertility assessment; (ii) evaluate the existence of a possible correlation between mRNA levels of DNA methyltransferases (DNMTs) and COL1A2 or COL3A1 in different Kenney and Doig’s endometrial categories and at different estrous cycle phases; (iii) evaluate the transcription and locus specific DNA methylation of COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP2, MMP9, TIMP1, and TIMP2 in different mare endometrial categories; (iv) investigate the in vitro epigenetic regulation in endometrial fibroblasts challenged with TGF-β1 and to assess the use of the epigenetic modifier, 5-aza-2′- deoxycytidine (5-aza-dC or decitabine), on endometrial fibroblasts exposed to profibrotic TGF-β1. Serum COL3 concentrations increased with more advanced Kenney and Doig´s endometrial categories. Serum COL3 concentration was also higher in infertile mares, when compared to fertile mares. Both sensibility and specificity of COL3 was most effective to differentiate mares from category I from all other categories. Only COL3 proved to be a possible biomarker of mare endometrial fibrosis. Concerning epigenetic studies, DNMT3B increased with endometrial category grade, and it was independent of estrous cycle phase. There were lower transcription levels of MMP2 and MMP9, simultaneously with higher DNA methylation percentage, in higher endometrial categories. The demethylating drug 5-aza-dC reduced the collagen expression (mRNA and protein) in TGF-β1 treated endometrial fibroblasts. A different approach via epigenetics may provide an alternative means to address mare endometrial fibrosis and a more in-depth knowledge of the pathophysiology of this condition

RESUMO - FIBROSE DO ENDOMÉTRIO DA ÉGUA: EPIGENÉTICA E NOVOS MARCADORES DE FIBROSE - A endometrose é uma das principais causas de infertilidade em éguas e envolve a deposição excessiva de matriz extracelular (ECM) no endométrio, tal como o colagénio do tipo I (COL1), e do tipo III (COL3). Na fibrose existe um desequilíbrio entre as metaloproteinases (MMPs) e os seus inibidores tecidulares (TIMPs), resultando na desregulação entre a degradação e a deposição de colagénio. O factor transformador de crescimento β1 (TGF-β1) é um dos principais sinais pró-fibróticos na diferenciação dos miofibroblastos, identificados pela expressão da α-actina do músculo liso (α-SMA), promovendo a produção de colagénio. As alterações no fenótipo dos fibroblastos estão associadas a modificações epigenéticas. As alterações epigenéticas são reversíveis, sendo por isso extremamente promissoras para uso terapêutico. A análise da metilação do DNA é um dos métodos mais utilizados na detecção de alterações epigenéticas. Os objetivos deste estudo foram: (i) avaliar se o COL1, COL3 e hidroxiprolina poderiam servir como possíveis biomarcadores sanguíneos no diagnóstico de endometrose equina e na avaliação da fertilidade; (ii) avaliar uma possível correlação entre os níveis de mRNA das DNA metiltransferases (DNMTs) e dos COL1A2 e COL3A1 em diferentes categorias de endométrio (Kenney e Doig) e as fases do ciclo éstrico das éguas; (iii) avaliar a transcrição e a metilação do DNA em locais específicos do COL1A1, COL1A2, COL3A1, MMP2, MMP9, TIMP1 e TIMP2 em diferentes categorias de endométrio; (iv) investigar a regulação epigenética, in vitro, em fibroblastos endometriais tratados com TGF-β1 e o uso do agente epigenético, 5-aza-2'- desoxicitidina (5-aza-dC ou decitabina), em fibroblastos previamente expostos a TGF-β1. A concentração sérica de COL3 aumentou nas categorias de endométrio mais avançadas, e foi também maior nas éguas inférteis, quando comparada com as férteis. A sensibilidade e a especificidade do COL3 foram mais eficazes na diferenciação das éguas da categoria I, das éguas das restantes categorias. Apenas o COL3 demostrou ser um possível biomarcador de fibrose endometrial nas éguas. Em relação aos estudos epigenéticos, a DNMT3B aumentou com a categoria endometrial, independentemente da fase do ciclo éstrico. Ocorreu uma menor transcrição da MMP2 e MMP9, concomitante com uma maior metilação do DNA, nas categorias de endométrio com maior grau de fibrose. O desmetilante, 5-aza-dC reduziu a expressão de colagénio (mRNA e proteína) nos fibroblastos endometriais tratados com TGF β1. Uma abordagem diferente da endometrose equina, através da epigenética, pode constituir uma alternativa para um conhecimento mais aprofundado da sua fisiopatologia

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