Efeito de redes extracelulares de neutrófilos em espermatozóides de burro

Dissertação de Mestrado Integrado em Medicina Veterinária, área científica de Clínica

A melhoria da eficiência reprodutiva na espécie asinina exige uma melhor compreensão da sua estratégia reprodutiva. A seleção espermática que ocorre no útero da burra conta com a ação de neutrófilos (PMN) capazes de formar redes extracelulares (“Neutrophil Extracellular Traps”; NETs), que permitem capturar espermatozóides (SPZ). Destes, alguns são mais tarde libertados, por ação de uma DNAse presente no plasma seminal, exibindo excelentes movimentos. Assim, este pode constituir o processo de seleção espermática desta espécie. Esta dissertação teve com objetivos (i) a formação in vitro de NETs por neutrófilos quando em presença de espermatozóides de burro; (ii) a avaliação do efeito da formação de NETs nos espermatozóides e (iii) quando submetidos à ação de uma DNAse. Para isto foram recolhidos ejaculados de burro e isolados neutrófilos a partir do sangue de burra de modo a formar cinco grupos de estudo: Sémen, SPZ-PMN, SPZ-PMN-DNAse, SPZ-PMN-DNAse-EP, SPZ-PMNEP. Aos grupos “SPZ-PMN-DNAse” e “SPZ-PMN-DNAse-EP” foi adicionada uma DNAse, enquanto que nos grupos “SPZ-PMN-DNAse-EP” e “SPZ-PMN-EP, as suspensões de SPZ e PMN foram filtradas pelo filtro de sílica EquiPure. Para cada grupo experimental, ao fim de 1 e 2 horas de incubação a 37ºC, foram analisados a viabilidade espermática através da coloração eosina-nigrosina e os parâmetros de movimento através do sistema de análise espermática CASA, a diferentes tempos de incubação. Depois da junção dos espermatozóides com os PMNs foi confirmada a formação de NETs, através da observação microscópica de halos e agregados de espermatozóides em redor dos PMNs. Após o contacto com as NETs, a viabilidade espermática diminuiu na presença de uma DNAse, em conjunto com a utilização do filtro de sílica EquiPure (EP), ao fim de 1h de incubação (p<0,05). Também neste grupo experimental se verificaram os valores mais elevados de VSL, LIN, STR e o menor valor de ALH (p<0,05), caracterizando este como o grupo com maior velocidade e linearidade, após 1h de incubação. Os restantes grupos não diferiram entre si no que concerne a sua viabilidade. O grupo espermatozóides-neutrófilos mostrou ser o menos veloz e menos linear de entre os restantes. Este estudo preliminar sugere a continuação da investigação no âmbito da endometrite fisiológica, de modo a melhor compreender o seu papel na seleção espermática e a sua importância para a fertilidade em burros, bem como o efeito da formação das NETs nos espermatozóides

ABSTRACT - Effect of neutrophil extracelular traps on donkey spermatozoa - Improving reproductive efficiency in donkey species requires a better understanding of its reproductive strategy. The sperm selection that occurs in the jennie’s uterus relies on the action of neutrophils (PMN) capable of forming neutrophil extracellular traps (NETs), which allow spermatozoa (SPZ) to be captured. Of these, some are released later, by the action of a DNAse present in the seminal plasma exhibiting excellent movements. Thus, this may constitute the sperm selection process of this species. The objectives of this dissertation were (i) the in vitro formation of NETs by neutrophils in the presence of donkey sperm; (ii) evaluation of the effect of NETs formation on sperm and (iii) when subjected to the action of a DNAse. For this purpose, donkey ejaculates were collected and neutrophils were isolated from jennie blood to form five study groups, as follows: Semen, SPZ-PMN, SPZ-PMN-DNAse, SPZ-PMNDNAse-EP, SPZ-PMN- EP. To the groups “SPZ-PMN-DNAse” and “SPZ-PMN-DNAse-EP” a DNAse, was added, while in the groups “SPZ-PMN-DNAse-EP” and “SPZ-PMN-EP, suspensions of SPZ and PMN were filtered by the silica filter EquiPure.: For each experimental group, after 1 and 2 hours of incubation at 37 ºC, sperm viability was analyzed using eosinnigrosin staining and movement parameters using the CASA sperm analysis system, at different incubation times. After the sperm joined the PMNs, the formation of NETs was confirmed by microscopic observation of halos and aggregates of sperm around the PMNs. After contacting with NETs, sperm viability decreased in the presence of a DNAse, in conjunction with the use of the EquiPure (EP) silica filter, after 1h of incubation (p<0.05). Also in this experimental group, the highest values of VSL, LIN, STR and the lowest value of ALH (p<0.05) were observed, characterizing this as the group with the highest speed and linearity, after 1 hour of incubation. The other groups did not differ in terms of their viability. The spermneutrophil group proved to be the slowest and the least linear among the others. This preliminary study suggests continued research in the field of physiological endometritis in order to better understand its role in sperm selection and its importance for fertility in donkeys, as well as the effect of NETs formation on sperm

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