Identification and characterization of effector proteins of the beet cyst nematode <em>Heterodera schachtii</em>

Plant parasitic nematodes (PPN) are considered as economically important pests of a wide range of plants including ornamentals, vegetables, and fruit trees. The beet cyst nematode <em>Heterodera schachtii</em> causes massive yield loss in sugar beet production. <i> H. schachtii</i> is a biotrophic sedentary endoparasite which depends on a specific hypermetabolic syncytial nurse cell structure in the host root. To induce and maintain the feeding site, <i> H. schachtii</i> uses a specific set of effector proteins that are secreted mostly from the oesophageal glands. Identification and functional analysis of these proteins are crucial steps to understand the nature of nematode parasitism. In our study, we sequenced the <i> H. schachtii</i> transcriptome via Illumina MiSeq. We compared the assembled <i> H. schachtii</i> transcriptome with the available nematode ESTs from NEMBASE4 and transcripts from available nematode transcriptomes in order to identify new effectors. We found 484 putative secretory proteins specific to plant-parasitic nematodes (PSP). Further comparison with known <i> H. schachtii</i> ESTs resulted in the identification of so far unknown PSPs. The annotation of the identified PSPs showed enrichment in certain gene ontologies such as metabolic and catalytic activities in addition to growth regulation function. We selected two genes for a detailed functional analysis. Through Pfam domain analysis, we identified “<em>HsPDI</em>” encoding a protein disulfide-isomerase domain and “<em>Hs-Tyr</em>” encoding a tyrosinase functional domain. To our knowledge, these two domains have not yet been described in the context of nematode effector proteins.<br /> Transcripts of both genes were localized in the esophageal gland of pre-parasitic juveniles, and their expression was found to be up-regulated during the parasitic developmental stages. Silencing of both genes by RNAi affected nematode development and syncytium formation: both females and syncytia were significantly smaller than the controls. On the contrary, ectopic expression of the effectors in Arabidopsis increased plant susceptibility to <i> H. schachtii</i>.<br /> Silencing of <em>HsPDI</em> led to syncytia with distinct ultrastructural changes such as less dense cytoplasm with distorted and degraded organelles. Treating <em>HsPDI</em>-expressing Arabidopsis plants with the defense inducing peptide flg22 triggered ROS burst, but the measured H₂O₂ level was lower compared with control plants. Furthermore, treating pre-infective nematode juveniles with H₂O₂caused up-regulation of <em>HsPDI</em> expression. Silencing <em>HsPDI</em> in pre-infective nematode juveniles induced higher sensitivity to H₂O₂ stress compared with untreated nematodes. Fluorescence microscopy of Nicotiana benthamiana leaves transiently expressing <em>HsPDI</em>::GFP showed that it is specifically located in the apoplastic space. Thus, our results demonstrate the importance of the <em>HsPDI</em> for the interaction between nematode and host as an apoplastic effector, and indicates the possible function of <em>HsPDI</em> as a scavenger of plant ROS.<br /> Ectopic expression of <em>Hs-Tyr</em> in Arabidopsis has a clear impact on plant growth: shoot growth was promoted and root architecture was changed. No changes where observed in the root length or weight. Additionally, the presence of <em>Hs-Tyr</em> in the plant caused changes in the homeostasis of several plant hormones especially auxin, jasmonate precursor cisOPDA and the ethylene precursor ACC. No significant changes of jasmonic acid and salicylic acid levels were observed. The transgenic plants were more susceptible to <i> H. schachtii</i>, but not to the root-knot nematode Meloidogyne incognita. This indicates that this effector is of specific importance for the parasitism of the cyst nematode <i> H. schachtii</i>. The results suggest that <em>Hs-Tyr</em> interferes with the orchestration of plant hormones in a still unknown way.<br /> The presented results show that the analyzed PSPs have specific effects on nematode-plant interaction and therefore serve as effectors facilitating parasitism.

Pflanzenparasitäre Nematoden sind wirtschaftlich bedeutsame Schaderreger an vielen landwirtschaftlichen Kulturen wie auch Zierpflanzen, Gemüse- und Obstarten. Der Rübenzystennematode <em>Heterodera schachtii</em> verursacht massive Ertragsverluste in der Zuckerrübenproduktion. <i> H. schachtii</i> ist ein biotropher, sedentärer Endoparasit, dessen Entwicklung von der Bildung eines hypermetabolischen Nährzellensystems in der Wurzel abhängt. Um dieses Nährzellensystem zu induzieren und auf Dauer zu erhalten, verfügt <i> H. schachtii</i> über Effektorproteine, die überwiegend in den Ösophagusdrüsen gebildet werden. Die Identifizierung und funktionelle Analyse dieser Effektoren sind wichtige Schritte auf dem Weg zu einem tieferen Verständnis des Parasitismus des Nematoden. Für unsere Analysen sequenzierten wir das Transkriptom von <i> H. schachtii</i> mit einem Illumina MiSeq Gerät. Anschließend wurde das zusammengesetzte Transkriptom mit den verfügbaren ESTs aus der Datenbank NEMABASE4 und Transkriptomen weiterer Nematoden verglichen, um neue Effektorseqzenzen zu identifizieren. Auf diese Weise wurden zunächst 484 mutmaßlich sekretierte Proteine (PSP) identifiziert. Eine weiterer Sequenzvergleich mit bekannten ESTs von <i> H. schachtii</i> führte zur Identifizierung bisher unbekannter PSPs. Die Annotation dieser neuen PSPs ergab eine Anreicherung bestimmter Genontologien wie z.B. metabolischen und katalytischen Aktivitäten und wachstumsregulierenden Funktionen. Es wurden zwei Gene für eine detaillierte funktionelle Analyse ausgewählt. Mit Hilfe einer Pfam-Domänenanalyse konnten “<em>HsPDI</em>”, das für eine protein disulfide-isomerase Domäne, sowie “<em>Hs-Tyr</em>”, das für eine Tyrosinase-Domäne kodiert, identifiziert werden. Beide Domänen waren bisher noch nicht in Zusammenhang mit Nematoden-Effektoren gebracht worden.<br /> Die Transkripte beider Gene konnten in den Ösophagusdrüsen von prä-infektiösen Nematodenlarven lokalisiert werden, wobei die Genexpression während der parasitischen Entwicklungsstadien aufreguliert ist. Das Stilllegen der beiden Gene mit Hilfe von RNAi hatte Auswirkungen auf die Nematodenentwicklung wie auch auf die Bildung des Nährzellensystems: sowohl Weibchen als auch Nährzellen waren kleiner als in unbehandelten Kontrollen. Im Gegensatz dazu führte die ektopische Expression der Gene in Arabidopsispflanzen zu einer erhöhten Anfälligkeit gegenüber <i> H. schachtii</i>. Die Stilllegung von <em>HsPDI</em> wirkte sich auf die Ultrastruktur der gebildeten Nährzellen in Form eines weniger dichten Zytoplasmas mit veränderten und degradierten Organellen aus. Wurden transgene Arabidopsispflanzen, die <em>HsPDI</em> exprimierten, mit dem Abwehr induzierenden Peptid flg22 behandelt, so reagierten diese mit starker ROS-Produktion, die H₂O₂-Konzentration war jedoch geringer als in nicht transgenen Kontrollpflanzen. Die Stilllegung von <em>HsPDI</em> in prä-infektösen Nematodenlarven führte zu deren erhöhter Sensitivität gegenüber einer Behandlung mit H₂O₂ im Vergleich zu einer Kontrollgruppe. Die fluoreszenzmikroskopische Analyse von Blättern von Nicotiana benthamiana, die <em>HsPDI</em>::GFP transient exprimierten, zeigte, dass <em>HsPDI</em> im Apoplasten lokalisiert ist. Die Ergebnisse der durchgeführten Experimente zeigen, dass <em>HsPDI</em> ein Effektor ist, der eine wichtige Rolle in der Interaktion zwischen Nematode und Wirtspflanze spielt, wobei es vermutlich als Radikalfänger für ROS pflanzlicher Herkunft fungiert.<br /> Die ektopische Expression von <em>Hs-Tyr</em> in Arabidopsis hatte eine deutliche Auswirkung auf das Pflanzenwachstum: Das Sprosswachtum war verstärkt, die Wurzelarchitektur war verändert, wobei die Wurzellänge und das Wurzelgewicht unverändert blieben. Die transgenen Pflanzen wiesen darüber hinaus deutliche Veränderung der Homöostase verschiedener Hormone, vor allem Auxin, dem Jasmonatvorläufer cisOPDA und dem Ethylenvorläufer ACC auf. Die Konzentrationen von Jasmonsäure und Salizylsäure waren dagegen gleich bleibend. Die transgenen Pflanzen waren gegenüber <i> H. schachtii</i> anfälliger, nicht jedoch gegenüber dem Wurzelgallennematoden Meloidogyne incognita. Daraus läßt sich schließen, dass der Effektor physiologische Prozesse in Gang setzt, die spezifisch für den Parasitismus des Zystennematoden <i> H. schachtii</i> von Bedeutung sind. Die bisherigen Ergebnisse weisen darauf hin, dass <em>Hs-Tyr</em> dabei in einer noch unbekannten Weise in den Hormonhaushalt der Pflanze eingreift.<br /> Die gewonnenen Erkenntnisse zeigen, dass die untersuchten PSPs spezifische Effekte auf die Interaktion zwischen Nematode und Pflanze haben und somit als Effektoren den Parasitismus des Nematoden unterstützen.