Natural bitumen is an extraordinary habitat for microorganisms

English. Microorganisms are found in almost every petroleum reservoir with moderate temperatures. Moreover, most of the world’s petroleum deposits are dominated by biologically altered heavy oil and bitumen. Most biodegradation in deep subsurface reservoirs takes place at the oil-water transition zone (OWTZ). This is the contact zone of a petroleum-bearing layer and an underlaying water leg. However, investigations of natural occurring processes in deep petroleum reservoirs are challenging due to a lack of undisturbed non-mixed samples. Furthermore, artificial cultivation causes changes in the microbial community composition and metabolic rates. Fortunately, a recent study found microbial life enclosed in microliter-sized water droplets dispersed in bitumen of the Pitch Lake, located in Trinidad and Tobago. These findings suggest that microbial life, and thus biodegradation additionally takes place in water enclosures independently of the OWTZ. These micro habitats are an exceptional opportunity to get representative insights in microbial life in deep subsurface petroleum reservoirs. However, the question occurs whether microbially inhabited water droplets are a generic trait in bitumen reservoirs rather than a unique phenomenon of the Pitch Lake. This study investigates microbial life enclosed in microliter-sized water droplets in bitumen, and its impact on the overall biodegradation process. Hence, samples were taken from three different bitumen seeps: The Pitch Lake (La Brea, Trinidad and Tobago), the La Brea Tar Pits (Los Angeles, California, USA), and an unnamed oil seep on the McKittrick oil field (McKittrick, California, USA). First investigations regarding dispersed water revealed the presence of 1-10 µl sized water droplets in all three tested bitumen seeps. Additional three-dimensional computed tomography scans of Pitch Lake bitumen revealed a multitude of smaller water inclusions <0.1 µl and only a minor fraction of 0.2 % of larger droplets. Thereby, these enclosed water droplets generate a bitumen-water interface of 1134 cm2 per liter bitumen on average, strongly enlarging the overall bioavailable bitumen-water interface in these reservoirs. Examinations of extracted water droplets from the three seeps showed astonishing cell densities of up to 109 cells ml-1 and an average cell number of 2.0 × 108 ± 3.6 × 107 cells ml-1 in all analyzed droplets. Viability tests with LIVE/DEAD staining proved that 53 % of the present microorganisms counted as membrane intact. Additionally, ATP determinations showed concentrations comparable to those of other subsurface ecosystems, confirming the presence of metabolic activity. Microbial community analyses based on 16S rRNA gene amplicon sequencing of water droplets revealed typical anaerobic microorganisms known to be involved in the oil-degradation process of other petroleum reservoirs around the world. Although the sampling sites were located at far apart places, all three bitumen seeps shared several operational taxonomic units (OTUs). Besides that, a core community of 8 OTUs was present in 97 to 100 % of all analyzed droplets. In situ cell staining in water droplets followed by microscopic investigations, as well as lectin staining of the bitumen surface in artificial microcosm setups, showed microbial cells attached to the bitumen surface imbedded by fluorescent structures. Furthermore, 16S rRNA gene amplicon sequencing of the bitumen surface revealed differences in the microbial community compositions compared to samples from the aqueous phase. The results all together strongly support the common idea of biofilm formation as the prevailing form of life within petroleum reservoirs. Degradation rates of Pitch Lake bitumen were measured by applying “reverse stable isotope labeling”. This method enables precise measurements of relatively low mineralization rates in the ng range. For this purpose, freshly taken bitumen samples were overlain with artificial brackish water and incubated for 945 days. The obtained data revealed a mineralization rate of 9.4−38.6 mmol CO2 per liter bitumen and year. This study confirms that inhabited, microliter-sized water droplets are a common feature in bitumen reservoirs. It was shown that the densely populated micro habitats harbor active and diverse microbial communities which are presumably organized in biofilms. In addition, evidence was provided that these water droplets considerably enlarge the bitumen-water interface and could play an important role in the overall degradation process in deep subsurface petroleum reservoirs regarding geological times scales. This study provides new insights into life in natural bitumen reservoirs away from the OWTZ and builds the foundation for further research on microbial ecology, syntrophic interactions, and metabolic processes in deep subsurface petroleum reservoirs.

German. Mikroorganismen können in fast allen Erdöllagerstätten mit gemäßigten Temperaturen nachgewiesen werden. Weltweit werden die meisten Erdöllagerstätten von biologisch abgebautem Schweröl und Bitumen dominiert. Der größte Teil des biologischen Abbaus in tiefen unterirdischen Lagerstätten findet an der Öl-Wasser-Übergangszone (eng. OWTZ) statt. Dies ist eine Kontaktzone zwischen einer erdölführenden Schicht und einer darunter liegenden Wasserschicht. Die Untersuchung natürlicher Prozesse in tiefen Erdöllagerstätten ist aufgrund mangelnder ungestörter und nicht durchmischter Proben schwierig. Zusätzlich führt eine künstliche Kultivierung zu Veränderungen in der Zusammensetzung von natürlich vorkommenden mikrobiellen Gemeinschaften und Abweichungen in den Stoffwechselraten. In einer aktuellen Studie wurden Mikroorganismen in mikrolitergroßen Wassertropfen gefunden, die im Bitumen des Pitch Lake in Trinidad und Tobago verteilt waren. Diese Einschlüsse deuten darauf hin, dass mikrobielles Leben und somit biologischer Abbau auch unabhängig von der OWTZ in Wassereinschlüssen vorkommen. Dadurch sind diese eingeschlossenen und separierten Mikrohabitate eine außergewöhnliche Möglichkeit allgemeine Einblicke in das mikrobielle Leben in tiefen unterirdischen Erdöllagerstätten zu erhalten. Es bleibt jedoch zu klären, ob mikrobiell besiedelte Wassertropfen ein generelles Merkmal in Bitumenlagerstätten sind oder nur eine Ausnahme im Pitch Lake. Diese Studie untersucht mikrobielles Leben in mikrolitergroßen Wassertropfen in Bitumen und seine Auswirkungen auf den gesamten biologischen Abbauprozess. Dafür wurden Proben aus drei unterschiedlichen Bitumenlagerstätten entnommen: Dem Pitch Lake (La Brea, Trinidad und Tobago), den La Brea Tar Pits (Los Angeles, Kalifornien, USA) und einer unbenannten Quelle auf dem McKittrick-Ölfeld (McKittrick, Kalifornien, USA). Erste Untersuchungen bezüglich kleinster Wassereinschlüsse bestätigten das Vorkommen von 1‑10 µL großen Wassertropfen in allen drei untersuchten Bitumenlagerstätten. Zusätzliche Untersuchungen mittels dreidimensionaler Computertomographie von Bitumen aus dem Pitch Lake zeigten eine große Anzahl kleinerer Wassereinschlüsse <0,1 µL und lediglich einen Anteil von 0,2 % mit größerem Volumen. Die eingeschlossenen Wassertropfen erzeugen eine Bitumen-Wasser-Grenzfläche von durchschnittlich 1134 cm2 pro Liter Bitumen, was die gesamte bioverfügbare Grenzfläche in Lagerstätten deutlich vergrößert. Weitere Untersuchungen von extrahierten Wassertropfen aus den drei Lagerstätten ergaben erstaunliche Zelldichten von bis zu 109 Zellen mL-1 und eine durchschnittliche Zellzahl von 2,0 × 108 ± 3,6 × 107 Zellen mL-1. Die Lebensfähigkeit der vorhandenen Zellen wurde mittels LIVE/DEAD-Färbung überprüft. Die Auswertung der Ergebnisse ergab, dass 53 % der vorhandenen Mikroorganismen als membran-intakt und somit als lebend galten. Darüber hinaus ergaben ATP-Messungen Konzentrationen, die vergleichbar sind mit denen anderer unterirdischer Ökosystemen, was das Vorhandensein metabolisch aktiver Mikroorganismen bestätigt. Die Analyse der mikrobiellen Gemeinschaft einzelner Wassertropfen auf der Grundlage von 16S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung zeigte typische anaerobe Mikroorganismen, deren Beteiligung an Abbauprozessen in Erdöllagerstätten auf der ganzen Welt bereits bekannt ist. Obwohl die Probenahmestellen an voneinander weit entfernten Orten lagen, teilten alle drei Bitumenlagerstätten gleich mehrere operative taxonomische Einheiten (eng. OTUs). Eine Gruppe von 8 OTUs war in 97 bis 100 % aller untersuchten Tropfen vorhanden. In-situ-Zellfärbung in Wassertropfen, gefolgt von mikroskopischen Untersuchungen, sowie die Färbung der Bitumenoberfläche in angelegten Mikrokosmen mit fluoreszenzmarkierten Lektinen, zeigten mikrobielle Zellen auf der Bitumenoberfläche, die nach der Lektinfärbung zusätzlich von fluoreszierenden Strukturen umgeben waren. Die 16S rRNA-Gen-Amplikonsequenzierung der Bitumenoberflächen zeigte deutliche Unterschiede in der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft im Vergleich zu Proben aus der wässrigen Phase. Die Ergebnisse untermauern die gängige Vorstellung der Biofilmbildung als vorherrschende Form des Lebens in Erdöllagerstätten. Darüber hinaus wurden die Abbauraten von Pitch Lake Bitumen durch "reverse stable isotope labeling" gemessen. Diese Methode ermöglicht die präzise Messung von relativ geringen Mineralisierungsraten im ng-Bereich. Dazu wurden frisch entnommene Bitumenproben mit künstlichem Brackwasser überlagert und 945 Tage lang inkubiert. Die Auswertung der erhaltenen Daten ergaben eine Mineralisierungsrate von 9,4‑38,6 mmol CO2 pro Liter Bitumen und Jahr. Diese Studie bestätigt, dass bewohnte, mikrolitergroße Wassertropfen ein gemeinsames Merkmal von Bitumenlagerstätten sind. Es konnte gezeigt werden, dass diese dicht besiedelten Mikrohabitate aktive und vielfältige mikrobielle Gemeinschaften beherbergen, die vermutlich in Biofilmen organisiert sind. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Wassertropfen die Bitumen-Wasser-Grenzfläche erheblich vergrößern und aufgrund der festgestellten Mineralisierungsrate, über geologische Zeiträume hinweg, eine wichtige Rolle im gesamten Abbauprozess in tiefen unterirdischen Erdöllagerstätten spielen könnten. Diese Studie bietet neue Einblicke in das mikrobielle Leben in natürlichen Bitumenlagerstätten abseits der OWTZ und bildet die Grundlage für weitere Forschung zur mikrobiellen Ökologie, zu syntrophen Interaktionen und Stoffwechselprozessen in tiefen unterirdischen Erdöllagerstätten.