Gold nanoparticles for genetic therapy of hemophilia B

English. The current standard therapy for hemophilia B comprises the life-long prophylactic administration of the coagulation factor IX (FIX). To efficiently avoid crippling bleeding episodes, frequent intravenous applications of FIX are necessary due to the short half-life of FIX in plasma. Multiple efforts to treat hemophilia B with gene therapy approaches have been pursued over the years. Only in the last decade, efficient gene transfer of a hyperactive FIX cDNA variant with recombinant AAV vectors has achieved the potential to become the new standard therapy. However, due to limitations of AAV therapy in terms of immunity, safety, patient inclusion criteria and costs, non-viral genetic therapies for hemophilia are worth pursuing. The focus of this thesis was to develop a nonviral gene therapy approach by transferring a hyperactive copy of the FIX gene into hepatic cells, thereby re-establishing production of the missing protein. Ideally suited as carrier system for the transport of DNA to the liver after intravenous injection are laser-ablated gold nanoparticles (AuNPs), as these anorganic nanoparticles are nontoxic, nonimmunogenic and safe when compared to viral vectors. To facilitate efficient binding/condensation of an optimized DNA vector to AuNPs, both are negatively charged, various positively charged polyethylenimine (PEI) variants were complexed with these two negatively charged ingredients and characterized for gene transfer efficiency and acceptable toxicity in human cell lines and primary rat hepatocytes. Variables tested in these experiments were different formulations of linear and branched PEI, different AuNP sizes and various FIX expression cassettes with viral- and human-derived promoters, in/exclusion of introns as well as codon-optimized versus wildtype cDNAs. Furthermore, gene transfer efficiencies achieved with chemically synthesized gold nanoparticles were absolutely no match for those observed with the laser-generated gold nanoparticle in any cell system and any condition tested. The best formulation of laser-generated AuNPs, PEI and DNA was also injected intravenously into wild-type Sprague-Dawley rats and the animals were sacrificed after defined time points. Importantly, dose escalation studies revealed that up to three intravenous injections with up to 3mg/kg AuNPs of two different sizes were very well tolerated and not associated with any toxicity. Analysis of eight different tissues by atomic absorption spectroscopy (AAS) demonstrated that 80-90% of the AuNPs were enriched in the liver as target organ 1 and 6 hours after injection. Proof of in vivo transgene expression in liver or spleen was not successful so far. In summary, a novel non-viral gene transfer platform capable of efficiently targeting the liver was established, based on a modular design of laser-generated gold nanoparticles, functionalized with PEI and a hyperactive FIX DNA that enabled high-level FIX activities in primary rat hepatocytes.

German. Die derzeitige Standardtherapie für Hämophilie B umfasst die lebenslange prophylaktische Gabe des Gerinnungsfaktors IX (FIX). Aufgrund der kurzen Halbwertszeit von FIX im Plasma ist eine häufige intravenöse Injektion von FIX erforderlich, um Blutungsstörungen, die langfristig zu Gelenkverkrüppelungen führen könne, wirksam zu vermeiden. Im Laufe der Jahre wurden mehrere Versuche unternommen, die Hämophilie B mit gentherapeutischen Ansätzen zu behandeln. Erst im letzten Jahrzehnt hat der effiziente Gentransfer einer hyperaktiven FIX-cDNA Variante mittels rekombinanter AAV-Vektoren das Potenzial erreicht, die neue Standardtherapie zu werden. Aufgrund der Limitierungen der AAV-Therapie in Bezug auf Immunität, Sicherheit, Patienteneinschlusskriterien und Kosten sind jedoch die Entwicklungen nicht-viraler Gentherapien für Hämophilie eine wichtige Alternative. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag daher auf der Entwicklung eines nicht-viralen gentherapeutischen Ansatzes, bei dem eine Kopie des FIX-Gens mit einer spezifischen hyperaktiven Punktmutation in Leberzellen transferiert und so die Produktion des fehlenden Proteins wiederhergestellt wird. Als Trägersystem für den Transport von DNA zur Leber nach intravenöser Injektion eignen sich insbesondere laserablatierte Goldnanopartikel (AuNPs), da diese anorganischen Nanopartikel im Vergleich zu viralen Vektoren nicht toxisch, nicht immunogen und sicher im Bezug auf Insertionsmutagenese sind. Um eine effiziente Bindung/Kondensation eines negativ-geladenen, optimierten DNA-Vektors an ebenfalls negative AuNPs zu ermöglichen, wurden verschiedene positiv-geladene Polyethylenimin-Varianten (PEI-Varianten) mit diesen beiden negativ-geladenen Bestandteilen funktionalisiert und auf die Gentransfereffizienz und akzeptable Toxizität in menschlichen Zelllinien und in primären Rattenhepatozyten untersucht. In diesen Experimenten wurden unterschiedliche Formulierungen von linearem und verzweigtem PEI, verschiedene AuNP-Größen, verschiedene FIX-Expressionskassetten mit viralen und humanen Promotoren, Ein-/Ausschluss von Introns, sowie codon-optimierte und Wildtyp-cDNAs getestet. Weiterhin zeigten Versuche mit chemisch synthetisierten Goldnanopartikeln, dass die hierbei generierten Gentransferraten, in keinem Zellsystem mit den Effizienzen vergleichbar sind, die mit lasergenerierten Goldnanopartikeln beobachtet wurden. Die beste Formulierung von lasergenerierten AuNPs, PEI und DNA wurde weiterhin in Wildtyp-Sprague-Dawley-Ratten intravenös injiziert, und die Tiere anschließend zu definierten Zeitpunkten getötet. Initiale Studien zur Dosissteigerung zeigten, dass bis zu drei intravenösen Injektionen mit jeweils 3 mg/kg AuNPs in zwei verschiedenen Größen sehr gut vertragen wurden und mit keiner Toxizität verbunden waren. Die Analyse von acht verschiedenen Geweben mittels Atomabsorptionsspektroskopie (AAS) zeigte, dass nach Injektion in die Schwanzvene, 80-90% der Goldmenge bereits nach einer bzw. sechs Stunden in der Leber als Zielorgan detektierbar sind. Der Nachweis einer in vivo Transgenexpression in Leber oder Milz war bisher nicht erfolgreich. Zusammenfassend wurde ein neues, nicht-virales Gentransfersystem, etabliert, mit dem die Leber als Zielorgan effizient transfiziert werden kann. Der modulare Aufbau, bestehend aus lasergenerierten Goldnanopartikeln, die mit PEI und einer hyperaktiven FIX-DNA funktionalisiert sind, ermöglicht dabei die effiziente Faktorexpression in primären Rattenhepatozyten.