Systematic analysis of alt-EJ regulation in irradiated cells at the interface of G0/G1 cell cycle phases: focus on growth factor signaling and CtIP

German. Ziel der vorliegenden Studie war es, weitere Einblicke in die Regulation des DNS-DSB-Reparaturwegs alt-EJ zu gewinnen. Determinanten, die die Effizienz dieses Reparaturwegs beeinflussen, sind die Zellzyklusdynamik, die Signalwege von Wachstumsfaktoren sowie die Funktion von CtIP. Diese Determinanten beeinflussen sich teilweise gegenseitig, sodass beschlossen wurde, die alt-EJ-Regulation an ihrer Schnittstelle zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden Experimente hauptsächlich am Übergang der G0-Phase, wenn alt-EJ nicht präsent ist, zur G1-Phase, wenn alt-EJ vorhanden ist, durchgeführt. Verwendete Zelllinien waren humanen Ursprungs und überwiegend nicht-tumorigen, was beispielhaft die DNS-DSB-Reparatur in gesundem Gewebe zeigt. Fibroblasten und Epithelzellen wurden ausgewählt, um zu zeigen, dass die beobachteten Effekte unabhängig vom Ursprung der Keimschicht waren. Die Auflösung von DNS-DSB durch den Reparaturweg c-NHEJ wurde durch die Behandlung mit einem DNA-PKcs-Inhibitor ausgeschlossen. In ersten methodischen Experimenten wurden die zeitlichen Anforderungen für den Austritt aus dem Zellzyklus in die G0-Phase und den anschließenden Wiedereintritt in den Zellzyklus untersucht, indem Serumentzug und –auffrischung durchgeführt wurden. Die durchflusszytometrische Analyse von PI- und Ki67-Intensität ermöglichte die Unterscheidung zwischen verschiedenen Zellzyklusphasen. Die Erzeugung von nicht-zyklierenden G0-Phase-Zellen durch Serumentzug und die Möglichkeit, sie durch Ki67-Immunfärbung zu identifizieren, ermöglichten die Untersuchung der DNS-DSB-Reparatur durch alt-EJ in diesen Zellen. DNS-DSB-Reparatur wurde mittels PFGE analysiert und ergab eine schwerwiegende Beeinträchtigung von alt-EJ in der G0-Phase. Der Wiedereintritt in den Zellzyklus wurde durch Serumauffrischung induziert und bewirkte eine vollständige Erholung von alt-EJ. Es war zudem wünschenswert, den frühesten Zeitpunkt zu bestimmen, zu dem alt-EJ nach Verlassen der G0-Phase initiiert werden würde. Daher wurde die durchflusszytometrische Analyse erweitert, um einzelne Zellzyklusphasen innerhalb der Menge der zyklierenden Zellen durch EdU-Färbung zuverlässiger zu unterscheiden. Die Überprüfung erfolgte durch Western-Blot-Analyse von Cyclinen. Zusätzlich wurde eine Auswahl von Zellzyklusinhibitoren verwendet, um G2-, S- und späte G1-Phase-Zellen schrittweise aus dem Versuchsaufbau auszuschließen. Überraschenderweise konnte die Erholung von alt-EJ auf die frühe G1-Phase eingegrenzt werden. Grundsätzlich würde man annehmen, dass G2-Phase-Zellen, die hocheffizient für alt-EJ sind, zur Wiederherstellung des Reparaturwegs beigetragen hätten. Dementsprechend war es erstaunlich zu sehen, dass G1-Phase-Zellen in der Lage waren, alt-EJ hinreichend anzuwenden. Die Wiederherstellung von stark beeinträchtigtem alt-EJ konnte auch durch die Verabreichung eines einzelnen Wachstumsfaktors, hier bFGF, induziert werden. Wachstumsfaktoren machen einen Großteils von Zellkulturseren aus, und es wurde angenommen, dass die Wiederherstellung von alt-EJ nach Serumauffrischung oder Behandlung mit bFGF eine Folge der Signalübertragung durch Wachstumsfaktoren ist. Die wichtigsten Wachstumsfaktor-Signalwege wurden durch Western blotting überprüft und Akt/pAkt und Erk/pErk als potentiell interessant für die Regulierung von alt-EJ eingestuft. Eine Modulationsfunktion für diese beiden Proteine konnte jedoch nicht nachgewiesen werden, und die Hypothese, dass Wachstumsfaktor-Signale an der alt-EJ-Regulation beteiligt sein könnten, erschien unwahrscheinlich und wurde vorerst zurückgewiesen. Die durchgeführte Untersuchung des Beitrags von Wachstumsfaktor-Signalen zur Regulierung von alt-EJ war recht punktuell, da die manuelle Untersuchung weiterer Signalfaktoren den Rahmen des aktuellen Projekts gesprengt hätte. Es wurde jedoch bereits gezeigt, dass Signale von Wachstumsfaktoren an der Modulation anderer DNS-DSB-Reparaturwege beteiligt sind, sodass sie im Kontext von alt-EJ weiterhin interessant erscheinen. In zukünftigen Projekten könnte es aufschlussreich sein, Screening-Techniken anzuwenden, um weitere vielversprechende Kandidaten zu ermitteln, beispielsweise durch enzymgebundene Immunosorbens-Assays. Abgesehen von der Wachstumsfaktorsignalisierung könnte eine Herunterregulierung von alt-EJ in der G0-Phase auch durch die nachgewiesene Herunterregulierung der CtIP-Proteinexpression in dieser Zellzyklus-Phase verursacht werden. Daher wurde beschlossen, die CtIP-Expression zu manipulieren und daraufhin die DNS-DSB-Reparatur zu messen. Die Verringerung der CtIP-Expression in G1-Phase-Zellen wurde durch das Antibiotikum Cycloheximid herbeigeführt. Dieses hemmt die gesamte Proteinsynthese. Die Behandlung koinzidierte mit einer Aufhebung von alt-EJ. Wichtig ist, dass dies ein erster Hinweis darauf ist, dass CtIP am Übergang von der G0- zur G1-Phase an der Erholung von alt-EJ beteiligt ist. In einem letzten Experiment wurde der Abbau von CtIP in der G0-Phase durch den Proteasom-Inhibitor Bortezomib verhindert. Die Behandlung mit Bortezomib löste die Beeinträchtigung von alt-EJ in dieser Zellzyklus-Phase teilweise auf und steigerte dessen Effizienz deutlich. Das ist für dieses Projekt von größter Bedeutung, da ansonsten die Erholung von alt-EJ nur dann festgestellt wurde, wenn G0-Phase-Zellen wieder in die G1-Phase eintraten. Hier konnte jedoch gezeigt werden, dass alt-EJ in der G0-Phase verwendet werden kann, wenn CtIP vorhanden ist. Der Beitrag von CtIP zur alt-EJ-Regulation könnte in zukünfitgen Studien weiter untersucht werden. Dies ist vor allem wichtig, da die hier verwendeten Reagenzien Cycloheximid und Bortezomib die gesamt Proteinexpression beeinflussten. Die ausschließliche Hemmung von CtIP sowie Knock-Downs oder Knock-Ins dieses Proteins würden das Wissen über die molekulare Regulation von alt-EJ schärfen. Darüber hinaus könnte die Verwendung von bereits vorhanden CtIP-Klonen, die die Herunterregulierung des Proteins beeinflussen, einen quantitativen Zusammenhang zwischen der Expression des Reparaturfaktors und der zellulären Radiosensibilisierung herstellen und die Entwicklung individualisierter strahlentherapeutischer Konzepte fördern.

English. The presented study aimed to bringing further insight into regulation of DNA DSB repair pathway alt-EJ. Determinants influencing efficiency of this pathway are cell cycle dynamics, growth factor signaling and CtIP function. Partially, these determinants influence each other mutually, so that it was decided to examine alt-EJ regulation at their interface. For this purpose, experimentation was conducted mainly at transition of G0 phase, when alt-EJ is absent, to G1 phase, when it is present. Used cell lines were human and predominantly non-tumorigenic, exemplifying DNA DSB repair in healthy tissue. Fibroblasts and epithelial cells were chosen to demonstrate that seen effects were independent from germinal layer origin. Resolution of DNA DSBs by repair pathway c-NHEJ was excluded by DNA-Pkcs inhibitor treatment. In a first methodological experiment set, temporal requirements for cell cycle exit to G0 phase and subsequent cell cycle re-entry were investigated by conducting SD and replenishment. Flow cytometric analysis for PI and Ki67 intensity allowed discrimination between different cell cycle phases. Generation of non-cycling G0 phase cells by SD and the possibility to identify them by Ki67 immunostaining enabled the investigation of DNA DSB repair by alt-EJ in these cells. DNA DSB repair was analyzed by PFGE and revealed a severe abrogation of alt-EJ in G0 phase. Re-entry into the cell cycle was induced by SR and caused complete recovery of alt-EJ. It was desirable to determine the earliest time point in which alt-EJ would be initiated after cells exit G0 phase. Therefore, flow cytometric analysis was expanded to more reliably distinguish single cell cycle phases within the subset of cycling cells by EdU staining. Verification was conducted by analysis of cyclins by Western blotting. Additionally, an assortment of cell cycle inhibitors was used to stepwise excluding G2, S and late G1 phase cells from the experimental setup and alt-EJ efficiency was measured thereupon. Surprisingly, rescue of alt-EJ could be curtailed to early G1 phase. One would assume that G2 phase cells, being highly efficient in alt-EJ, would have contributed to the pathway recovery. So it was astonishing to see that G1 phase cells were sufficiently capable of rescuing alt-EJ. Rescue of abrogated alt-EJ could be induced by single growth factor administration, here bFGF, as well. Growth factors constitute a major part of cell culture serum and it was assumed that rescue of alt-EJ upon SR and bFGF treatment might be a result of growth factor downstream signaling. Major signaling pathways were monitored by Western blotting and Akt/pAkt and Erk/pErk were considered to be potential of alt-EJ. However, a modulating function for these two proteins could not be detected and the hypothesis that growth factor downstream signaling would be involved in alt-EJ regulation appeared unlikely and was rejected for the time being. The conducted investigation of growth factor signaling contribution to alt-EJ regulation was quite punctiform as the manual examination of more signaling factors would have been beyond the scope of the current project. Nevertheless, growth factor signaling was shown to be involved in the modulation of other DNA DSB repair pathways, so it remains interesting in the context of alt-EJ. In future projects, it might be interesting to apply screening techniques to find further promising candidate proteins, for example by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Aside from growth factor signaling, downregulation of alt-EJ in G0 phase could be also caused by the detected downregulation of CtIP protein expression. Therefore, it was decided to manipulate its expression and to measure DNA DSB repair thereupon. Decrease of CtIP expression in G1 phase cells was conducted by application of the antibiotic cycloheximide which inhibits overall protein synthesis. This treatment was coincidental with an abrogation of alt-EJ. Importantly, this was a first hint of CtIP being involved in alt-EJ recovery at the transition from G0 to G1 phase. In a final experiment, degradation of CtIP in G0 phase was prevented by proteasome inhibitor bortezomib. Bortezomib treatment resolved alt-EJ abrogation partially and clearly improved its efficiency in G0 phase. This is of paramount importance for this thesis as, elsewise, rescue of alt-EJ was only detected when cells re-entered G1 phase. But here it could be shown that alt-EJ can be employed in G0 phase if CtIP is present. Contribution of CtIP to alt-EJ regulation should be further investigated in future studies, as here used cycloheximide and bortezomib affected overall protein expression. Exclusive inhibition of the protein as well as CtIP knock-downs or knock-ins would sharpen the knowledge about the molecular regulation of alt-EJ. Additionally, utilization of already existing cellular clones of CtIP, affecting its downregulation, could establish a quantitative connection between expression of the repair factor and cellular radiosensitization and could boost the development of individualized radiotherapy rationales.