Reconstitution and characterisation of MPS1 kinetochore receptor, a key component of the Spindle Assembly Checkpoint response

English. The progression of the eukaryotic cell cycle is controlled by three main checkpoint systems, able to stop the cell at specific stages until the conditions for the advancement through the following steps have been achieved. The SAC mechanism, in particular, prevents the exit from mitosis until equal segregation of the genomic material into the two daughter cells can be ensured and is switched off only once chromosomes reach a state called ‘bi-orientation’. Each sister chromatid of a bioriented chromosome is attached to microtubules emanating from opposite spindle poles, with kinetochores bridging the interaction between chromatids and microtubules. Dysfunctions at this stage of the cell cycle can lead to aneuploidy, making the SAC an essential machinery for the survival of the cell. Mitotic kinases play a fundamental role in the activation of the SAC response and, therefore, in keeping the integrity of the genetic information during cell division. MPS1 kinase, in particular, activates the SAC after being recruited to the outer part of the kinetochore, by directly phosphorylating the conserved MELT repeats on the outer-kinetochore component KNL1. This creates the docking sites for the recruitment of all the other downstream players. The aim of my PhD project was to shed light on the complex mechanism underlying MPS1 kinetochore recruitment and the following SAC activation. With my work I could shed light on some of the molecular aspects of MPS1 interaction with the outer kinetochore components. Namely, I found NDC80C coiled-coil region, rather than its N-terminal domain, to play a fundamental role in direct MPS1 binding. Related to this observation, I could also provide evidence against the competition mechanism - between MPS1 and microtubules - claimed to control MPS1 release from kinetochores. Finally, we unveiled the contribution of KNL1 in MPS1 kinetochore recruitment and provided evidence with both in vitro and in vivo experiments that a single point mutation on the N-terminal region of this large kinetochore protein can disrupt this interaction. In conclusion, this work shows that MPS1 retention at kinetochores relies on the interaction with at least two kinetochore components, either concomitantly or sequentially contributing to its recruitment. The final model also speaks against the existence of a competition between microtubules and MPS1 in the interaction with NDC80C. Further analysis will be needed in order to provide more suitable hypothesis for MPS1 disengagement from kinetochores.

German. Das Fortschreiten des eukaryotischen Zellzyklus wird durch drei wichtige Kontrollsysteme gesteuert, die die Zelle in bestimmten Stadien anhalten können, bis die Bedingungen für das weitere Fortschreiten erreicht sind. Der SAC-Mechanismus verhindert insbesondere den Austritt aus der Mitose bis eine gleichmäßige Aufteilung des Genmaterials auf die beiden Tochterzellen gewährleistet ist und wird erst ausgeschaltet, wenn die Chromosomen einen Zustand erreicht haben, der als "Biorientierung" bezeichnet wird. Jedes Schwesterchromatid eines biorientierten Chromosoms ist an Mikrotubuli befestigt, die von den gegenüberliegenden Spindelpolen ausgehen, wobei die Kinetochore die Interaktion zwischen den Chromatiden und Mikrotubuli vermitteln. Funktionsstörungen in dieser Phase des Zellzyklus können zu Aneuploidie führen, sodass der SAC eine kritische Maschinerie für das Überleben der Zelle darstellt. Mitotische Kinasen spielen eine grundlegende Rolle bei der Aktivierung der SACReaktion und tragen dadurch zur Integrität der genetischen Informationen während der Zellteilung bei. Der SAC wird insbesondere durch die Kinase MPS1 aktiviert, nachdem sie an den äußeren Teil des Kinetochors rekrutiert wurde und die konservierten MELTrepeats der äußeren Kinetochor-Komponente KNL1 direkt phosphoryliert hat. Dadurch werden die Andockstellen für die Rekrutierung aller anderen nachgeschalteten Akteure geschaffen. Ziel meines Promotionsprojekts war es, den komplexen Mechanismus der MPS1- Kinetochor-Rekrutierung und der anschließenden SAC-Aktivierung zu untersuchen. In meiner Arbeit konnte ich einige molekulare Aspekte der Interaktion zwischen MPS1 und den äußeren Kinetochor-Komponenten aufklären. So konnte ich aufzeigen, dass die Coiled-Coil-Region des NDC80-Komplexes und nicht seine N-terminale Domäne eine grundlegende Rolle bei der direkten MPS1-Bindung spielt. Im Zusammenhang mit dieser Beobachtung konnte ich auch das Konkurrenzmechanismus-Modell entkräften, dem zufolge die MPS1-Freisetzung von Kinetochoren durch die Bindung von Mikrotubuli erfolgt. Schließlich konnten wir den Beitrag von KNL1 zur KinetochorRekrutierung von MPS1 aufdecken und sowohl durch in vitro- als auch durch in vivoExperimente nachweisen, dass eine einzige Punktmutation in der N-terminalen Region dieses großen Kinetochor-Proteins die Interaktion stören kann. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass das Verbleiben von MPS1 an den Kinetochoren von der Interaktion mit mindestens zwei Kinetochor-Komponenten abhängt, die entweder gleichzeitig oder nacheinander zu seiner Rekrutierung beitragen. Das abschließende Modell spricht außerdem gegen eine Konkurrenz zwischen Mikrotubuli und MPS1 bei der Interaktion mit dem NDC80-Komplex. Weitere Analysen werden erforderlich sein, um eine geeignetere Hypothese für die MPS1- Verdrängung von den Kinetochoren zu finden.