Selection and characterization of human recombinant antibodies against Orthopoxviruses from an immunoglobulin library and mapping of functional epitopes of Vaccinia virus surface proteins

Die Gattung der Orthopockenviren (OPXV) lässt sich der Familie der Poxviridae zuord-nen, die eine Gruppe großer, doppelsträngiger DNA Viren umfasst. Diese replizieren sich im Cytoplasma von Wirbel- und Wirbellosentieren, welches eine Besonderheit unter den DNA-Viren darstellt. Vaccinia Virus (VACV) wurde, aufgrund der Kreuzreaktivität zwi-schen den nah miteinander verwandten Pockenviren, als Impfstoff gegen Variola Virus (VARV) eingesetzt. Es wird angenommen, dass VARV mehr Todesfälle, als alle anderen menschlichen Infektionskrankheiten zusammen, auslöste. Der strikten VACV-Impfkampange ist es jedoch zu verdanken, dass VARV vollständig ausgerottet werden konnte. Aufgrund der Beendigung dieser Impfkampagne ist jedoch ein Großteil der Menschheit nicht mehr geschützt, weswegen VARV sowie auch die Affenpockenviren (MPXV) als potentielle biologische Waffen genutzt werden könnten. Auch andere zoono-tische OPXV Arten, wie z.B. Kuhpockenviren (CPXV), können die menschliche Ge-sundheit, insbesondere die, immungeschwächter Menschen, gefährden. Daher ist die Entwicklung sichererer Impfstoffe, antiviraler Wirkstoffe und rekombinanter humaner Antikörper essentiell. Die Morphogenese von VACV führt zu zwei verschiedenen Haupt-Viruspartikelformen. Die Mehrheit (>90%) besteht aus dem "intracellular mature virus" (IMV), dass die Übertragung von Wirt zu Wirt vermittelt. Während das „extracellular enveloped virus“ (EEV) für die direkte Übertragung von Zelle zu Zelle innerhalb des Wirts wichtig ist. Hervorzuheben ist außerdem, dass das EEV von einer zusätzlichen Hül-le umgeben ist. Ein weiterer Unterschied zwischen den IMVs und den EEVs sind die unterschiedlichen Hüllproteine. Unter anderem wurden am IMV A10, A13, A14, A17, A25, A27, A28, C3, D8, D13, H3 und L1 und A33, A56, B5 und F13 am EEV identifi-ziert. Im Laufe meiner Dissertation habe ich mich auf die VACV Proteine A27, D8 und F13 konzentrieren, da diese wichtige Funktionen im Virusreplikationszyklus übernehmen. Eines der am besten charakterisierten Hüllproteine ist das A27, dass vom offenen Leser-ahmen (ORF) A27L kodiert wird. Dieses konservierte Protein ist in allen OPXV-Arten vorhanden. Es ist ein wichtiger Bestandteil für die Virusanheftung, indem es an das Gly-cosaminoglycan (GAG) Heparansulfat auf der Oberfläche von Säugetierzellen bindet. In dieser Arbeit konnten die Bindungsstellen von sechs monoklonalen A27-spezifischen Antikörpern (mAks) mit Hilfe der Peptid-SPOT-Synthese und der Peptid-Microarray-Technologie identifiziert werden. Im Bereich der Aminosäuren (AS) 26 bis 39 wurde ein Komplex von vier antigenen Bereichen detektiert (Epitop #1A: AS 32-39, #1B: AS 28-33, #1C: AS 26-31, #1D: AS 28-34). Des Weiteren wurden ein N-terminales (Epitop #4: AS 9-14) und ein C-terminales Epitop (Epitop #5: AS 68-71) identifiziert. Durch ELISA-Tests mit verschiedenen OPXVs-Referenzstämmen konnten die Bindungsaffinitäten be-stimmt werden. Interessanterweise zeigten alle, gegen den Epitopkomplex #1 gerichteten mAKs eine starke Bindung mit VACV, CPXV und Camelpox-Viren (CMLV), reagierten jedoch nicht oder nur schwach mit Ektromelie-Virus (ECTV) und MPXV. Diese Unter-schiede sind auf die Austausche in der Aminosäuresequenz der Epitopregion zurück zu führen. Um diese Sequenzvariabilität der sechs antigenen Bereiche zu bestimmen, wurden 391 bisher veröffentlichte A27 OPXV Sequenzen miteinander verglichen. Das Epitop #4 zeigte sich bei fast allen OPXV Arten konserviert. Ausnahmen bildeten jedoch drei Büf-felpocken Viren (BPXV), drei Stinktierpocken Viren (SkPXV), 12 N-terminal verkürzte OPXV-Sequenzen und eine VACV-Sequenz. Das Epitop #5 war in 389 der insgesamt 391 Sequenzen konstant. Der Epitopkomplex #1A-D zeigte sich variabler und ist daher für die spezies-spezifischen Eigenschaften des Epitops verantwortlich, welche auch durch die ELISA-Ergebnisse bestätigt werden konnten. Darüber hinaus wurden die Neutralisa-tionsfähigkeiten der A27-spezifischen mAks getestet, wobei die mAks, die die Epitope #1A-D und #4 detektieren, VACV Elstree in Anwesenheit von einem Prozent humanem Komplement neutralisierten (50% Plaquereduktion: 12,5-200 µg/ml). Ein weiteres IMV-Protein ist das D8 Protein, ein Membranprotein Typ 1, welches bei der Anheftung von Viren an die Wirtszelle durch das GAG-Chondroitinsulfat (CS) ebenfalls eine wichtige Rolle spielt. Um Neutralisationsstudien durchführen zu können, wurden spezifische humane anti-D8-Antikörper generiert. Daher wurde das IgG-Repertoire von vier Spendern, die zuvor mit dem Vaccinia-Lebendvirus geimpft wurden, amplifiziert, kloniert und von M13K07ΔpIII-Phagen präsentiert. Diese Bibliothek zeigte eine Vielfalt von ≥4×108 unabhängigen Kolonien. Verschiedene Screening-Protokolle gegen VACV Elstree zeigten eine vermehrte Selektion von spezifischen anti-D8 scFv-Klonen. D8 ist für die Induktion starker Antikörperreaktionen bekannt. Um die Bindungsaffinität und die Immunantwort verbessern zu können, wurde das scFv-1.2.2.H9 durch die größeren scFv-Fc-1.2.2.H9 und IgG1-1.2.2.H9 Formate erweitert. Die scFv-1.2.2.H9 und scFv-Fc-1.2.2.H9 Formate zeigten ähnliche Bindungsaffinitäten (1,61 nM bzw. 7,68 nM), wohin-gegen das IgG1-1.2.2.H9 eine viel effizientere Bindung aufwies (43,82 pM). Jedoch neutralisierte keiner der gereinigten rekombinanten 1.2.2.H9-Antikörperformate 100 pfu VACV Elstree in vitro. Interessanterweise konnten, nach der Zugabe von einem Prozent humanem Komplement, die Neutralisationsfähigkeiten der größeren Antikörperformate scFv-Fc-1.2.2.H9 und IgG1-1.2.2.H9 verbessert werden (0,0776 uM bzw. 0,01324 uM). In vivo, hingegen, konnten 100 µg des scFv-1.2.2.H9 sowie auch des IgG1-1.2.2.H9 teilweise (3/6 Mäusen) gegen die Infektion mit 4LD50 VACV München1 schützen. Un-erwarteterweise zeigte scFv-Fc-1.2.2.H9 keine Schutzwirkung. Zudem wurde die bestehende OPXV-Phagenbibliothek erneut gegen das VACV F13 Protein gescreent. Bei dem F13 Protein handelt es sich um ein nicht glykosyliertes Memb-ranprotein, welches von dem ORF-F13L-Gen kodiert wird. Das F13 Protein wurde im Bereich des Trans-Golgi-Netzes und der Plasmamembran der Wirtszelle nachgewiesen. Es liegt jedoch nicht exponiert auf der Oberfläche der Viren vor, sondern befindet sich überwiegend an der Innenseite der Virushülle. Das F13 Protein ist, ebenso wie das A27 Protein, für die Umhüllung der IMV und damit für die Ausbildung der EEV essentiell. Nachdem die OPXV Phagenbibliothek gegen das F13 Protein gescreent wurde, wurde das scFv 3E2 isoliert und mit Hilfe der Peptid-SPOT-Synthese weiter charakterisiert. In-teressanterweise ergaben sich für das scFv 3E2 zwei antigene Bereiche (139-GSIHTIKTLGVYSDY-153 und 169-AFNSAKNSWLNL-188). Es konnte keine VACV-Neutralisation in vitro erzielt werden, da sich das F13 Protein (und somit das Epitop) auf der Innenseite der Virushülle befindet. Zusammenfassend ist die weitere Forschung der Replikationszyklen von Pockenviren von großer Bedeutung. Besonders sollte die Kartierung funktioneller Epitope der A27 und D8 VACV Proteine im Vordergrund stehen, da Antikörper gegen diese Proteine bei der Im-munantwort im Höchsten Maße verfügbar sind. Darüber hinaus ermöglicht das Wissen über mögliche spezies-spezifische Epitopvarianten die zukünftige Entwicklung sichererer Impfstoffe und Virostatika. Die Konstruktion rekombinanter scFv-Phagenbibliotheken ist darüber hinaus eine vielversprechende Strategie zur Hestellung spezifisch konstruierter humaner rekombinanter scFv-Antikörper, die dazu beitragen können, zukünftige Ausbrü-che von zoonotischen OPXV-Infektionen zu kontrollieren.

The genus Orthopoxvirus (OPXV) contains a group of large (130-380 kb) and closely related double-stranded DNA viruses within the Poxviridae family, which replicates in the cytoplasm of vertebrate or invertebrate cells. Vaccinia virus (VACV), the prototype of the OPXV genus, was applied as a vaccine against the closely related Variola virus (VARV). VARV, the causative agent of smallpox, elicited more fatalities than all other human dis-eases taken together. However, strict VACV-vaccination campaign led to the eradication of smallpox. Another advantage of the vaccination is the achievement of cross protection against all the other OPXVs. Unfortunately, due to the termination of the vaccination campaign, the majority of humans is not protected anymore. Therefore, there is considera-ble concern regarding the use of VARV and monkeypox virus (MPXV) as potential bio-logical weapons, especially after recurrent outbreaks of MPXV in Africa, America and Europe. Moreover, reservoirs for other closely related OPXVs, e.g. cowpox viruses (CPXV), exist in the environment and may also endanger human health, especially in im-muno-compromised humans. Therefore, it is crucial to join forces in the development of safer vaccines, antiviral agents, and protective human recombinant antibodies for passive immunization. Morphogenesis of VACV results mainly in two distinct virus particle forms. The majority (>90%) consists of the “intracellular mature virus” (IMV), which mediates host-to-host transmission. “Extracellular enveloped virus” (EEV) on the other hand is important for direct cell-to-cell transmission inside the host and is surrounded by an additional golgi-derived envelope. Another difference between IMVs and EEVs is the distribution of envelope proteins, as several structural proteins of immunological rele-vance were identified on the IMV (A10, A13, A14, A17, A25, A26, A27, A28, C3, D8, D13, H3 and L1), and on the EEV (A33, A56, B5 and F13). In my PhD thesis, studies on antibody-viral interaction with focus on the VACV proteins A27, D8 and F13 were conducted, because of their important functions in the virus repli-cation cycle. One of the best characterized envelope proteins is the A27, which is encoded by the open reading frame (ORF) A27L. This conserved protein is present in all members of OPXVs. A27 is important for virus attachment, by binding to the glycosaminoglycan (GAG) heparan sulfate on the surface of mammalian cells. In this study, the binding sites of six specific A27 monoclonal antibodies (mAbs) were identified by peptide SPOT syn-thesis and peptide microarray technology. In the region of amino acids (aa) 26 to 39, a complex of four antigenic sites was identified (epitope #1A: aa 32-39, #1B: aa 28-33, #1C: aa 26-31, #1D: 28-34), and another two at the N-terminus (epitope #4: aa 9-14) and C-terminus (epitope #5: aa 68-71). Binding affinities were determined using ELISAs with different purified OPXV reference strains. Interestingly, all mAbs directed to epitope complex #1 showed strong binding activities to VACV, CPXV and camelpox virus (CMLV) but either did not react or only bound weakly to ectromelia virus (ECTV) and MPXV. These differences are caused by amino acid exchanges of the epitope regions. To determine the sequence variability of the six antigenic sites, 391 published sequences of A27 protein homologs were compared. Epitope #4 was conserved among almost all OPXVs with the exception of three buffalopox viruses (BPXV), three skunkpox viruses (SkPXV), 12 truncated OPXV sequences and one VACV sequence, while epitope #5 was constant among 389 of the 391 sequences. The sequential epitope complex #1A-D was more variable and, therefore, responsible for species-specific epitope characteristics, which is in correspondence to the ELISA results. Moreover, the neutralization capabilities of A27 specific mAbs were tested, whereby the mAbs detecting epitopes #1A-D and #4 neutralized VACV Elstree in the presence of 1% complement (50% plaque-reduction: 12.5-200 µg/ml). Another crucial IMV protein is the D8 type 1 membrane protein, which is highly con-served in poxviruses. It plays an important role in virus attachment to the host cell via binding to the GAG chondroitin sulfate (CS). For neutralization studies, specific human anti-D8 antibodies were generated. Therefore, the IgG repertoire from four donors vac-cinated intracutaneously with live vaccinia virus vaccine was amplified, cloned and dis-played onto M13K07ΔpIII phage. This library displayed a diversity of ≥4x108 independ-ent colonies. Different immuno-screening protocols against VACV Elstree revealed a predominant selection of scFv-clones specifically binding to the D8 protein, which is known to induce strong antibody responses. To improve the binding affinity and the im-mune response, the obtained scFv-1.2.2.H9 was also engineered into the larger human scFv-Fc-1.2.2.H9 and IgG1-1.2.2.H9 formats. Similar binding affinities were shown by scFv-1.2.2.H9 and scFv-Fc-1.2.2.H9 (1.61 nM and 7.68 nM, respectively), whereas, IgG1-1.2.2.H9 was much more efficient (43.82 pM). However, none of the purified re-combinant 1.2.2.H9 antibodies were able to neutralize 100 pfu of VACV Elstree in vitro. Interestingly, after addition of 1% human complement, the neutralization abilities of the larger antibody formats scFv-Fc-1.2.2.H9 and IgG1-1.2.2.H9 could be improved (0.0776 µM and 0.01324 µM, respectively). In an in vivo passive immunization NMRI-mouse-model, 100 µg of scFv-1.2.2.H9 and the IgG1-1.2.2.H9 partially protected the mice against the challenge with 4LD50 VACV Munich 1 as 3/6 animals survived. In con-trast, the mice inoculated with scFv-Fc-1.2.2.H9 showed no protection. Moreover, the existing OPXV phage library was screened against the F13 protein of VACV, which is the major envelope protein of EEV particles. The nonglycosylated F13 membrane protein is encoded by the ORF F13L gene. The F13 protein has no transmem-brane domain, instead, its N- and C-terminus are both directed towards the inner side within the EEV membrane. Because of its location in the TGN membrane, it plays an im-portant role in the virion wrapping progress as well as the EEV production. After apply-ing immuno-screening protocols against F13, one anti-F13 scFv was isolated and charac-terized. Interestingly, two antigenic binding sites (139-GSIHTIKTLGVYSDY-153 and 169-AFNSAKNSWLNL-188) were mapped using a cellulose membrane encompassing 372 15-mere peptides with 12 overlaps, therefore covering the whole F13 protein. Be-cause of the inner location of the protein, scFv 3E2 showed no capability of VACV neu-tralization. In conclusion, more research on poxvirus replication is crucial. The epitope mapping on immuno-protective proteins such as the A27 and D8 proteins of VACV provides more insights into host-pathogen interaction. Moreover, data on virus species-specific epitope variations will enable the future development of safer vaccines or antivirals. The construc-tion of recombinant scFv phage libraries is a promising strategy to produce target specific antibodies which are useful to investigate the replication cycle of poxviruses. Moreover, these libraries are of high interest because they enable generating specifically engineered human recombinant scFv antibodies, which might be a helpful tool for controlling any future eruption of zoonotic OPXV infections.