The role of glutathione transferases in herbicide detoxification - a genome-wide study on flufenacet resistant black-grass

In Europa ist die Resistenz des Ackerfuchsschwanzes (Alopecurus myosuroides Huds.) gegen Nachauflaufherbizide bereits weit verbreitet. Darüber hinaus entwickelt sich eine Resistenz gegen Vorauflaufherbizide wie die Herbizide der Gruppe 15, darunter Flufenacet. Der Mechanismus der Resistenz ist bereits beschrieben und wird durch die Hochregulierung von Glutathiontransferasen (GSTs) vermittelt, die Flufenacet-Glutathion-Konjugate bilden. Ziel dieser Studie ist es, die Herbizidresistenz von Ackerfuchsschwanz besser zu charakterisieren, und zwar durch (i) die Validierung von GST-Kandidaten bei dem Abbau von Flufenacet und anderen Herbiziden, (ii) die Untersuchung der Kreuzresistenz auf individueller Proteinebene, (iii) die Untersuchung ihrer Regulierung auf Transkriptionsebene und (iv) eine kurze Untersuchung der Entwicklung und Nomenklatur der GSTs, die in Ackerfuchsschwanz vorkommen. Zu diesem Zweck wurden GST-Kandidatengene, die in Flufenacet-resistenten Ackerfuchsschwanzpopulationen hochreguliert sind − abgeleitet durch Alignment von RNA-Seq gegen das kürzlich zusammengestellte Ackerfuchsschwanzgenom – für eine in vitro Validierung ihrer Aktivität auf Flufenacet mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ausgewählt und ihre abgeleiteten Metaboliten wurden weiter mittels Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) analysiert. Insgesamt waren alle fünf GST-Gene in der Lage, den Syntheseinhibitor für sehr langkettige Fettsäuren (VLCFA) Flufenacet in ein Flufenacet-Glutathion-Konjugat oder in einem einzigen Fall in Flufenacet-Alkohol umzuwandeln. Alle wiesen niedrige Abbauraten auf und könnten in Pflanzen nach der Anwendung von Flufenacet eine additive Wirkung haben, was die langsame Resistenzentwicklung von Flufenacet erklären könnte, die auf einer polygenen und generalistischen Resistenz beruht. Es kann jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass andere GST-kodierende Gene zum Abbau von Flufenacet beitragen. Darüber hinaus waren alle getesteten GSTs in der Lage, den VLCFA-Inhibitor Acetochlor und den Acetyl-CoA-Carboxylase (ACCase)-Inhibitor Fenoxaprop-Ethyl abzubauen, und eine GST baute den VLCFA-Inhibitor Pyroxasulfon ab. Die anderen getesteten Herbizide desselben Wirkmechanismus waren jedoch nicht betroffen, was die Tatsache unterstreicht, dass die metabolische Resistenz komplex ist und nicht unbedingt eine starke Resistenz gegen ein breites Spektrum von Herbiziden verleiht. Außerdem wurde nachgewiesen, dass dasselbe Enzym eine Kreuzresistenz mit anderen Wirkmechanismen bewirken kann, während andere Wirkstoffe desselben Wirkmechanismus oder sogar derselben chemischen Klasse möglicherweise nicht betroffen sind. Darüber hinaus hat sich gezeigt, dass der Wechsel zwischen verschiedenen Wirkstoffen eine wichtige Rolle bei der Verlangsamung der Resistenzentwicklung spielt. Darüber hinaus wurden alle GSTs im Genom des Ackerfuchsschwanzes identifiziert, was diese Studie zur ersten genomweiten GST-Analyse des Ackerfuchsschwanzes macht. Es zeigte sich, dass das Ackerfuchsschwanz 115 GST-Gene besitzt, was für eine diploide Art eine große Zahl ist und eine günstige Voraussetzung für die Anpassung an wiederholte Herbizidbehandlungen in modernen landwirtschaftlichen Systemen darstellt. Sie gehören zu 11 verschiedenen Klassen: Tau (GSTU), Phi (GSTF), Lambda (GSTL), Zeta (GSTZ), Theta (GSTT), Dehydroascorbat-Reduktase (DHAR), Tetrachlorhydrochinon-Dehalogenase (TCHQD), Glutathionyl-Hydrochinon-Reduktase (GHR), Hemerythrin (GSTH), Metaxin (MTX), mikrosomale Prostaglandin-E-Synthase Typ 2 (mPGES2). Die am häufigsten vorkommenden und exprimierten Klassen waren die GSTUs und GSTFs, die typischerweise in Clustern zu finden waren. Die hohe Anzahl von GST-Genen und die Clusterbildung sind höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer Genomverdopplung (WGD) und einer Tandem-Genduplikation, gefolgt von einer Diploidisierung, und werden auch durch die Bewegung von transponierbaren Elementen (TEs) innerhalb des Genoms beeinflusst. Die Promotoren der GST-Gene und die 5' stromaufwärts gelegenen regulatorischen Regionen (5' URRs) bis zu 2 kb, die cis-regulatorische Elemente (CREs) enthalten, wurden in silico untersucht, um Unterschiede zwischen den nicht-differenziell und den differenziell exprimierten GST-Genen zu erkennen. Darüber hinaus wurde ein CRE-Kandidat, der das Bindungselement für den Transkriptionsfaktorkomplex E2F/DP ist und den Promotoren von drei hochregulierten GSTU-Genen gemeinsam ist, mit Hilfe eines elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungstests (EMSA) weiter untersucht. Insgesamt waren die Unterschiede in der Expression zwischen GSTs größer als zwischen resistenten und sensitiven Individuen, und obwohl Gene im selben Cluster oft ähnlichen Expressionsmustern folgen, haben Promotorsequenzen wahrscheinlich einen stärkeren Einfluss auf die Genexpression als der Genort. Diese Studie lieferte eine biochemische Validierung der Aktivität der am stärksten differenziert exprimierten GST-Isoformen von Flufenacet-resistentem Ackerfuchsschwanz gegenüber Flufenacet und anderen Vor- und Nachauflaufherbizide in einem in vitro basierten Assay, der die Abbauwege von Flufenacet und Kreuzresistenzmuster aufzeigt. Diese Erkenntnisse werden zu einem besseren Verständnis der Entwicklung der Flufenacet-Resistenz führen und könnten zu einem besseren und weniger resistenzfördernden Unkrautmanagementsystem im Feld beitragen. Schließlich kann das Verständnis der molekularen Mechanismen, die eine Flufenacet-Resistenz hervorrufen, eine Grundlage für die Verbesserung von Pflanzenschutzmitteln und Produktmischungen bilden.

Resistance of black-grass (Alopecurus myosuroides Huds.) to post-emergent herbicides is already widespread in Europe. In addition to that, resistance to pre-emergent herbicides is evolving such as Group 15 herbicides, among those flufenacet. The mechanism of resistance is already described and mediated by upregulation of glutathione transferases (GSTs) forming flufenacet-glutathione conjugates. The aim of this study is to better characterise black-grass herbicide resistance by (i) the validation of candidate GSTs on flufenacet and other herbicides detoxification, (ii) the investigation of cross-resistance at the individual protein level, (iii) investigation of their regulation at the transcriptional level and (iv) briefly explore the evolution and nomenclature of the GSTs found in black-grass. For that purpose, candidate GST genes found upregulated in flufenacet resistant black-grass populations – derived by re-alignment of RNA-Seq to the recently assembled black-grass genome – were chosen for in vitro validation of their activity on flufenacet using high-performance liquid chromatography (HPLC) and their derived metabolites were further analysed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS/MS). In total, all the five GST genes were able to metabolise the very-long-chain fatty acid (VLCFA) synthesis-inhibitor flufenacet into flufenacet-glutathione conjugate or in a unique case flufenacet-alcohol. All exhibited low detoxification rates and might have an additive effect in planta after flufenacet application, which can explain the slow resistance evolution of flufenacet, underlying a polygenic and generalist resistance. However, it cannot be ruled out that other GST encoding genes contribute to flufenacet detoxification. Moreover, all tested GSTs were able to detoxify the VLCFA-inhibitor acetochlor and the acetyl-CoA carboxylase (ACCase) inhibitor fenoxaprop-ethyl and one GST detoxified the VLCFA-inhibitor pyroxasulfone. But the other herbicides of the same mode of action tested were not affected, highlighting the fact that metabolic resistance is complex and does not necessarily confer strong resistance to a wide spectrum of herbicides. Besides, it was demonstrated that the same enzyme can confer cross-resistance with other modes of action, while other active ingredients of the same mode of action or even same chemical class may not be affected. Moreover, the alternation between active ingredients has also been shown to play an important role in slowing down the development of resistance. Moreover, all the GSTs in the black-grass genome were then identified, making this study the first genome-wide GST analysis of black-grass. It was revealed that black-grass has 115 GST genes, which is a large number for a diploid species and a favorable condition for adaptation to repetitive herbicide treatments in modern agricultural systems. They belong to 11 different classes: tau (GSTU), phi (GSTF), lambda (GSTL), zeta (GSTZ), theta (GSTT), dehydroascorbate reductase (DHAR), tetrachlorohydroquinone dehalogenase (TCHQD), glutathionyl-hydroquinone reductase (GHR), hemerythrin (GSTH), metaxin (MTX), microsomal prostaglandin E synthase type 2 (mPGES2). The most abundant and expressed classes were the GSTUs and GSTFs which were typically found in clusters. The high number of GST genes and the clustering event is most likely a result of a whole genome duplication (WGD) and tandem gene duplication followed by diploidizationdiploidization, and also is influenced by the movement of transposable elements (TEs) within the genome. The promoters of the GST genes and the 5' upstream regulatory regions (5' URRs) up to 2 kb containing cis regulatory elements (CREs) were studied in silico in order to detect differences between the non-differentially and differentially expressed GST genes. Moreover, a candidate CRE, which is the binding element for the transcription factor complex E2F/DP and common to the promoters of three upregulated GSTU genes was further investigated using an electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Overall, differences in expression between GSTs were greater than between resistant and sensitive individuals, and although genes in the same cluster often follow similar expression patterns, promoter sequences are likely to have a stronger effect on gene expression than gene location. This study provided biochemical validation of the activity of the highest differentially expressed GST isoforms of flufenacet resistant black-grass on flufenacet and other pre- and post-emergent herbicides in an in vitro based assay, demonstrating the detoxification pathways of flufenacet and cross-resistance patterns. This knowledge will lead to a better understanding of the evolution of flufenacet resistance and may contribute to a better and less resistance-favoured weed management system in the field. Finally, understanding the molecular mechanisms that induce flufenacet resistance may provide a basis for improving crop protection products and product mixtures.

2024-04-26