The importance of reproductive traits and pollinators for increased use of heterosis in faba bean (Vicia faba L.)

Die Acker- oder Fababohne (Vicia faba L.) ist eine Körnerleguminose und wird auf allen Kontinenten angebaut. Ihre proteinreichen Samen werden für die menschliche und tierische Ernährung verwendet. In den letzten Jahren wurde die heimische Produktion von Eiweißpflanzen durch die deutsche und europäische Politik gefördert, dennoch bleibt die Anbaufläche von Kulturen wie Ackerbohne oder Erbse in Europa begrenzt. Ein gängiges Problem im Anbau von Ackerbohnen ist die begrenzte Ertragsstabilität der derzeitigen Sorten. Die begrenzte Ertragsstabilität ergibt sich aus der Empfindlichkeit der Ackerbohne gegenüber biotischen und abiotischen Stressfaktoren und verhindert einen großflächigen Anbau von Ackerbohnen. Sowohl das Ertragsniveau als auch die Ertragsstabilität können durch eine Erhöhung der Heterozygotie und Heterogenität der Sorten verbessert werden. Die Ackerbohne vermehrt sich jedoch partiell allogam, was es schwierig macht, die optimale Zuchtstrategie für Ackerbohnen zu finden. Eine gängige Strategie in der Ackerbohnenzüchtung ist die Entwicklung von synthetischen Sorten. Synthetische Sorten werden erstellt, indem eine begrenzte Anzahl überlegener Inzuchtlinien als Komponenten ausgewählt und als offen bestäubter Mischbestand räumlich isoliert von anderen Ackerbohnen angebaut wird. Die Generation, in der die elterlichen Komponenten gemischt werden, wird als Syn-0 bezeichnet. Die darauffolgenden Generationen der Saatgutvermehrung entstehen durch natürliche Bestäubung und ohne weitere Selektion. Sie werden Syn-1, Syn-2, Syn-3 genannt, und Saatgut in Generation Syn-4 wird in der Regel an Landwirt*innen verkauft. Bei solchen synthetischen Sorten können das Ertragsniveau und die Ertragsstabilität durch einen höheren Anteil an Heterosis gesteigert werden, der wiederum durch einen höheren Grad an Fremdbefruchtung zwischen den Pflanzen erhöht wird. Der Fremdbefruchtungsgrad wird definiert als Anteil der fremdbefruchteten Samen an allen Samen und ist ein entscheidender Parameter für die Ertragsvorhersage in der Züchtung. Aktuelle Ansätze zur Vorhersage der Inzucht und des Heterosisanteils basieren auf einem konstanten und identischen Fremdbefruchtungsgrad bei allen Genotypen. Anspruchsvollere Ansätze berücksichtigen auch genotypspezifische Fremdbefruchtungsgrade, bei denen davon ausgegangen wird, dass alle Genotypen ihren Pollen gleichermaßen zu den fremdbefruchteten Samen beitragen. Ich gehe jedoch davon aus, dass sich Ackerbohnen-Genotypen in ihren Erfolgsquoten als Pollenspender, d. h. in ihrem Vaterschaftserfolg, unterscheiden. In diesem Fall würde der realisierte Heterosisanteil und folglich das Ertragsniveau der synthetischen Populationen sinken. Die Fremdbefruchtung bei der Ackerbohne wird durch verschiedene Bienenarten bewirkt, denn Bienen sind die erforderlichen Vektoren, um den Pollen zwischen Blüten und Pflanzen zu übertragen. Die Bienenbestäubung hat mehrere Auswirkungen auf den Ertrag der Ackerbohne. Eine Auswirkung besteht darin, dass die Bienen die Befruchtungsrate fördern. Während der Bestäubung lösen Bienen eine mechanische Stimulation der Blüte aus, wodurch sie die Samenbildung der Ackerbohnenpflanze ermöglichen oder steigern. Auf diese Weise beeinflussen Bienen direkt das Ertragsniveau auf einem bestimmten Feld. Ein weiterer Effekt, der für die Züchtung und die Saatguterzeugung von Bedeutung ist, besteht darin, dass die Bienen Fremdbefruchtung bewirken. Die Bestäubung durch Bienen führt zu einem Anstieg der Heterozygotie in der nachfolgenden Generation und verbessert damit die Ertragsleistung der Ackerbohnenpopulation. Somit profitiert die Ackerbohne von der Bienenbestäubung, da Bienen den Samenansatz verbessern und Fremdpollen übertragen. Ziel meiner Dissertation ist es, verschiedene Reproduktionsmerkmale der Ackerbohne zu charakterisieren und die Effektivität der verschiedenen Bestäuber zu verstehen. Mit den Erkenntnissen können die Bestäubung, die Fremdbefruchtung und der Vaterschaftserfolg in synthetischen Ackerbohnensorten optimiert und dadurch die Heterosis besser genutzt werden. Dementsprechend wurden zwischen 2014 und 2016 an der Georg-August-Universität Göttingen Feldexperimente, Topfexperimente im Freiland und Bestäuberstudien durchgeführt. Um die Variation des Frendbefruchtungsgrades und die Variation des Vaterschaftserfolgs zu quantifizieren, wurden diese Merkmale im ersten Kapitel bei 16 Ackerbohnengenotypen (vier F1-Hybriden und 12 Inzuchtlinien) untersucht, die in vier Polycrossen zusammengesetzt aus jeweils acht Genotypen angebaut wurden. Der väterliche Genotyp der geernteten Samen wurde anhand von SNP-Markern (Single Nucleotide Polymorphism) identifiziert. Bei beiden Merkmalen wurde eine deutliche und signifikante Variation innerhalb der Gruppe der Inzuchtlinien und innerhalb der Gruppe der F1-Hybriden sowie zwischen Inzuchtlinien und F1en festgestellt. Um die mögliche Bandbreite der Auswirkungen des unterschiedlichen Vaterschaftserfolgs zu ermitteln, wurden zwei extreme Szenarien der Synthetik-Zusammensetzung diskutiert, Szenario eins mit gleichem Vaterschaftserfolg aller Linien und Szenario zwei mit maximalen Unterschieden im Vaterschaftserfolg. Es wurde festgestellt, dass größere Unterschiede im Vaterschaftserfolg ab Syn-2 zu einem deutlich höheren Inzuchtkoeffizienten führen. Um also in einer synthetischen Sorte ein hohes Ertragsniveau zu erreichen, sollte die synthetische Sorte aus Inzuchtlinien bestehen, die eine hohe Eigenleistung und einen hohen genotypspezifischen Fremdbefruchtungsgrad aufweisen, sowie als Gruppe nur geringe Unterschiede im Vaterschaftserfolg aufweisen. Da die direkte Erfassung der Vaterschaft aufwändig und kostspielig ist, wird im zweiten Kapitel untersucht, ob Fortpflanzungsfaktoren wie Pollenproduktion und Pollenvitalität als Ersatzmerkmale für den Vaterschaftserfolg verwendet werden können. In Feldversuchen und in Topfexperimenten im Freiland wurden 14 Inzuchtlinien und vier F1-Hybriden der Winterbohne auf Pollenproduktion, Pollenvitalität und Autofertilität untersucht. Die Pollenproduktion lag im Topfversuch zwischen 18000 und 25000 Pollenkörnern pro Blüte und war an den unteren Blütenständen höher als an den oberen. Innerhalb der Inzuchtlinien fanden wir signifikante Unterschiede in der Pollenproduktion, und es gab Heterosis für dieses Merkmal. Im Feldversuch war die Pollenproduktion geringer und die Rangkorrelation zu den Daten aus dem Topfversuch war gering. Daher scheint die Pollenproduktion von Ackerbohnen umweltspezifisch zu sein, und die Genotypen sollten daher in der Umgebung phänotypisiert werden, in der die Samenproduktion stattfinden soll. Die relative Pollenvitalität war hoch (93 % – 97 % im Topfversuch, 88 % – 95 % im Feldversuch), was darauf hindeutet, dass der Befruchtungserfolg bei Ackerbohnen nicht durch eine geringe Pollenqualität eingeschränkt wird. Nur im Freiland war der Pollen von F1-Hybriden vitaler als der Pollen von Inzuchtlinien. Die Autofertilität reichte von 0 % bis 98 %, wobei die durchschnittliche Elternmittel-Heterosis für dieses Merkmal sehr ausgeprägt war. Daraus wurde gefolgert, dass die Autofertilität weder mit der Pollenproduktion noch mit der Pollenvitalität oder dem Vaterschaftserfolg zusammenzuhängen scheint. Jedoch waren die Pollenproduktion und die Pollenvitalität bei den sechs im Feld getesteten Inzuchtlinien stark mit dem Vaterschaftserfolg korreliert. Bei der Auswahl von Inzuchtlinien als Komponenten eines Synthetiks könnten Daten über die Pollenproduktion und die Pollenvitalität nützlich sein, um Komponenten mit geringen Unterschieden im Vaterschaftserfolg auszuwählen, um dadurch die Inzucht zu verringern und die Heterosis besser zu nutzen. Im dritten Kapitel wurden Mechanismen untersucht, die der Bienenbestäubung zugrunde liegen, und es wurde der Frage nachgegangen, ob sich die einzelnen Bienenarten in ihrer Bestäubungseffizienz bei der Ackerbohne unterscheiden. Das Sammelverhalten von Bienen in Ackerbohnenfeldern wurde anhand von Transektbegehungen erfasst und die artspezifische Blütenkonstanz anhand von Pollenanalysen ermittelt. Außerdem untersuchten wir die artspezifischen Auswirkungen von Bienenbestäubung auf den Samenansatz und den Fremdbefruchtungsgrad. Es zeigte sich, dass die beiden lokal dominierenden Bestäuberarten, die Honigbiene Apis mellifera und die Erdhummel Bombus terrestris agg., keine effiziente Bestäubungsleistung erbrachten, da sie hauptsächlich Nektar raubten. Die seltenere Gartenhummel Bombus hortorum erwies sich jedoch als die effizienteste Bestäuberart. Sie besuchte die Blüten durchgehend regulär zur Bestäubung, wies eine hohe Blütenkonstanz auf und bewirkte zusätzlich einen erhöhten Samenansatz. Der durch B. hortorum bewirkte Fremdbefruchtungsgrad war mit 45 % höher als bei allen anderen Arten. B. terrestris agg., B. lapidarius, B. pascuorum und Apis mellifera bewirkten jeweils weniger als 20 % Fremdbefruchtung. Diese Studie hat gezeigt, dass weniger häufige und spezialisiertere, langrüsslige Bestäuberarten die Bestäubung und Fremdbefruchtung der Ackerbohne verbessern können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass nicht alle Genotypen einer Ackerbohnenpopulation gleichermaßen als Pollenspender zur Reproduktion beitragen und dass die Annahme eines gleichen Vaterschaftserfolgs aller Genotypen zu stark vereinfacht ist und nicht auf der biologischen Realität beruht. Folglich ist die genetische Veränderung von einer synthetischen Generation zur nächsten komplexer als bisher angenommen. Für eine optimale Züchtung von synthetischen Sorten bei Kulturpflanzen mit beträchtlichen Unterschieden im Vaterschaftserfolg könnten Daten zur Pollenproduktion und Pollenvitalität nützlich sein, um Komponenten mit geringen Unterschieden im Vaterschaftserfolg auszuwählen. Außerdem hat sich die Gartenhummel B. hortorum als die effizienteste Bestäuberart erwiesen, die den höchsten Grad an Fremdbefruchtung und den größten Samenansatz bei Ackerbohnen bewirkt. Dementsprechend sollten synthetische Populationen in Umwelten mit großen und vitalen Beständen an B. hortorum vermehrt werden, um den genotypspezifischen Fremdbefruchtungsgrad zu maximieren und eine höhere Heterozygotie in nachfolgenden Ackerbohnengenerationen zu erreichen. Die vorgestellten Ergebnisse bieten das Potenzial für ein besseres Management und eine bessere Ausnutzung der Heterosis bei der Ackerbohne, um das Ertragsniveau und die Ertragsstabilität dieser vielseitigen Eiweißpflanze zu verbessern.

The grain legume faba bean (Vicia faba L.) is grown on all continents for its protein-rich seeds, which are used for human and animal nutrition. In recent years, domestic production of protein crops has been supported by German and European policies but the acreage of crops such as faba bean or pea remains limited in Europe. One major agronomic problem of current faba bean cultivars is limited yield stability which results from their sensitivity towards biotic and abiotic stresses and impedes a large-scale cultivation of faba beans. Both, yield level and yield stability are improved by increasing heterozygosity and heterogeneity of cultivars. Due to its partial allogamy, finding the optimal breeding strategy for faba bean is challenging. A prevalent strategy for faba bean improvement is the development of open pollinated synthetic cultivars. Synthetic cultivars are developed by selecting a limited number of superior inbred lines as components and by growing them as open-pollinated mixed stand in spatial isolation. The generation in which the parental components are mixed is called Syn-0. The consecutive seed multiplication generations result from natural pollination and without further selection. They are called Syn-1, Syn-2, Syn-3, and seed in generation Syn-4 is typically sold to farmers. In such synthetic cultivars, yield level and yield stability can be increased by improving the share of heterosis which in turn is increased by higher levels of cross-fertilization between the plants. The degree of cross-fertilization is defined as percentage of cross-fertilized seeds among all seeds and is a crucial parameter in breeders’ predictions of yield level. Current approaches to predict inbreeding and share of heterosis are based on a constant and identical degree of cross-fertilization of all genotypes. More sophisticated approaches also consider genotype-specific degrees, where all genotypes are assumed to contribute their pollen equally to the cross-fertilized seeds. However, I expect faba bean genotypes to differ in their success rates as pollen donors, i.e., in paternal outcrossing success. In this case, the share of heterosis realized in synthetic populations and consequently yield level would be reduced. Cross-fertilization in faba bean is realized by different bee species, as bees are the required vectors that transmit pollen between flowers and plants. Bee pollination has several effects on faba bean yield. One effect is that bees induce fertilization by mechanically stimulating the flower during legitimate flower visits, by which they enable or increase seed set of the faba bean plant. Thereby, bees directly influence the yield level on a given field. Another effect, which is relevant in breeding and seed production, is that bees effectuate cross-fertilization. Hence, pollination by bees leads to an increase in heterozygosity in the subsequent generation and thereby improves performance of the faba bean population. Thus, faba bean benefits from bee pollination because bees improve seed set and bees transfer cross-pollen. My dissertation thesis aims at characterizing different reproductive traits in faba bean and at understanding the effectiveness of pollinators, to optimize pollination, cross-fertilization and paternal outcrossing success and thereby make a better use of heterosis in synthetic faba bean cultivars. Accordingly, field experiments, outdoor pot-experiments and pollinator studies were conducted between 2014 and 2016 at the Georg-August-University of Göttingen. To quantify the variation of the degree of cross-fertilization and the variation of the paternal outcrossing success, in the first chapter, these traits were assessed in 16 faba bean genotypes (four F1 hybrids and 12 inbred lines), grown in four polycrosses composed of eight genotypes each. The paternal genotype of harvested seeds was identified using single nucleotide polymorphism (SNP) markers. In both traits, a marked and significant variation among inbred lines and among F1 hybrids was found, as well as between inbred lines and F1. To explore the possible range of the impact of differential paternal outcrossing success, two extreme scenarios of synthetics were discussed, scenario one with equal paternal outcrossing success for all lines and scenario two with maximal differences of paternal outcrossing success. It was concluded that larger differences in paternal outcrossing success result in a markedly higher inbreeding coefficient from Syn-2 onwards. Thus, to achieve a high yield level in a synthetic cultivar, the synthetic should be composed of inbred lines that have a high per-se performance and high genotype-specific degree of cross-fertilization, and, as a group, low differences among them in paternal outcrossing success. Since direct assessments of paternity are elaborate and costly, the second chapter addresses whether components of plant fitness such as pollen production and pollen viability could be used as a proxy for paternal success. In field and caged outdoor pot experiments, 14 inbred lines and four F1 hybrids of winter faba bean were evaluated for pollen production, viability and autofertility. Pollen production was between 18000 and 25000 pollen grains per flower in the pot experiment and higher at the lower than at upper inflorescences. Inbred lines differed significantly in pollen production, and we found heterosis for this trait. Pollen production was lower in the field and rank correlation to pot data was low. Hence, pollen production seems to be environment-specific, and genotypes should therefore be phenotyped in the environment where seed production shall take place. The relative pollen viability was high (93 % – 97 % in pots, 88 % – 95 % in field) indicating that fertilization success is not limited by a low pollen quality. Only in the field, pollen of F1 hybrids was more viable than pollen of inbred lines. Autofertility ranged from 0 % – 98 %, with very marked average mid-parent heterosis for this trait. It was concluded that autofertility did not seem to be related to either pollen production, pollen viability or paternal success. However, pollen production and pollen viability were highly correlated with paternal success in the six inbred lines tested in the field. When selecting inbred lines as components of a synthetic, data on pollen production and viability might be useful for choosing components with small differences in paternal successes, to reduce inbreeding and better exploit heterosis. In the third chapter, mechanisms underlying bee pollination were studied and the question of whether individual bee species differed in their efficiency to pollinate faba bean was addressed. We studied the foraging behavior of bee pollinators in faba bean fields using transect walks, and the species-specific flower constancy based on pollen analyses. Further, we examined the species-specific effects of bee pollinators on seed set and degree of cross-fertilization. It was found that the two locally dominant pollinator species, Apis mellifera and Bombus terrestris agg., did not provide efficient pollination service since they mostly robbed nectar. The less frequent species Bombus hortorum, however, was found to be the most efficient pollinator. It exhibited only legitimate flower visits, high flower constancy and additionally increased seed set. The degree of cross-fertilization realized by B. hortorum was with 45 % larger than any other species. B. terrestris agg., B. lapidarius, B. pascuorum, and Apis mellifera effectuated less than 20 % cross-fertilization each. This study demonstrated that less frequent and more specialized pollinator species with long tongues can improve pollination and cross-fertilization of faba bean. In conclusion, this thesis shows that the assumption that all genotypes of a faba bean population contribute equally to reproduction as cross-pollen donors is overly simplistic and not grounded on biological reality. Consequently, the genetic change from one synthetic generation to the next is more complex than previously assumed. For optimal breeding of synthetics of crops with appreciable differences in paternal outcrossing success, data on pollen production and viability might be useful for choosing components with small differences in paternal successes. Further, B. hortorum was shown to be the most efficient pollinator species effectuating the highest degree of cross-fertilization and the largest seed set of faba beans. Accordingly, synthetic populations should be propagated in environments with large and vital B. hortorum populations, to maximize the genotype-specific degree of cross-fertilization and realize higher heterozygosity in subsequent faba bean generations. The presented findings offer the potential for a better management and exploitation of heterosis in faba bean to improve yield level and yield stability of this versatile protein crop.

2024-05-23