Isolierung von DNA aus rohem und bearbeitetem Holz von Dipterocarpaceen | ISOLATION OF DNA FROM UNPROCESSED AND PROCESSED WOOD OF DIPTEROCARPACEAE

Entwaldung stellt die hauptsächliche Bedrohung der globalen biologischen Vielfalt dar und verursacht erhebliche Umweltzerstörung insbesondere in den Tropenregionen, die die höchste Artendichte beherbergen. Ein Drittel der weltweiten Entwaldung ist durch Holzeinschlag bedingt, der zu über 50% illegal erfolgt (Brack, 2003). Bei den Dipterocarpaceen handelt es sich um eine artenreiche Familie von Bäumen, die im tropischen Gürtel auf den Kontinenten Südamerika, Afrika und Asien beheimatet ist. Die Dipterocarpaceen werden häufig auf Tropenholzmärkten gehandelt und nehmen somit eine bedeutende Stellung in der Wirtschaft vieler südostasiatischer Staaten ein. In vielen Regionen sind die Dipterocarpaceen jedoch erheblich gefährdet aufgrund von Entwaldung und nicht nachhaltiger Bewirtschaftung. Gegen den illegalen Holzeinschlag wurden viele Maßnahmen von Regierungs- und Nichtregierungsorganisationen ergriffen. Einige Verbände der Holzindustrie haben Richtlinien erlassen,! die ihre Mitglieder verpflichten, nur Holz aus legaler und nachhaltiger Wirtschaft zu beziehen. Hieraus ergibt sich die Notwendigkeit, Werkzeuge zu entwickeln, die die Bestimmung der Herkunft des Holzes ermöglichen und damit die Prüfung der Glaubwürdigkeit von Herkunftsbescheinigungen erlauben. Methoden der molekularen Genetik erweisen sich als nützlich, die Identität einer Art zu bestätigen und sind vielversprechende Werkzeuge der Bestimmung der geographischen Herkunft des geschlagenen Holzes. Zur Anwendung des molekulargenetischen Ansatzes müssen zwei Bedingungen erfüllt sein: Zum Einen müssen Protokolle zur Isolierung von DNA in hinreichender Menge und Qualität aus rohem oder bearbeitetem Holz entwickelt werden. Zum Zweiten sind diagnostische DNA-Marker zu identifizieren, die eine hohe räumliche Auflösung aufweisen müssen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Etablierung von Methoden der DNA Extraktion für das Holz der Dipterocarpaceae. Zum Beginn dieser Arbei! t wurden mehrere veröffentlichte Methoden der DNA Isolierung ! sowie k ommerzielle Extraktionskits an verschiedenen Proben von rohem und bearbeitetem Holz untersucht. Die Extrakte wurden mittels PCR analysiert, um den Erfolg der Extraktion nachzuweisen. Die optimierte DNeasy Plant mini Kit (Qiagen) Methode (Rachmayanti et al., 2006) wird als die effizienteste Methode angesehen. Diese Methode überzeugt durch den kleinen Maßstab und die Anwendbarkeit in einem standardmäßig ausgestatten Genlabor. Nichtsdestotrotz erbringt sie eine hinreichende Menge und Qualität für PCR Amplifizierung und weitere nachfolgende Methoden wie DNA Genotypisierung, Klonierung und Sequenzierung. Die Zugabe von Polyvinylpyrrolidon (PVP) zum Lysepuffer ist wichtiger Bestandteil dieser Methode, da hierdurch die Hemmung der PCR signifikant vermindert werden kann. Holzproben unterschiedlicher Arten, Typen (roh und bearbeitet), geographischer Herkunft und Zustand wurden in dieser Arbeit untersucht. Insgesamt 406 Proben, bestehend aus 332 Proben von Dipterocarpaceae und ! 74 von anderen Holzarten wurden analysiert. Eine Untersuchung mit Chloroplasten-DNA-Marker zeigte erfolgreiche Amplifizierung in 369 von 406 PCR Experimenten (90,9%) beim kurzen Fragment (ccmp2, etwa 150 bp), 319 von 406 PCR Experimenten (76,6%) beim mittellangen Fragment (trnL, etwa 600 bp) und 234 von 406 PCR Experimenten (57,6%) beim langen Fragment (trnLF, etwa 1,100 bp). Der durchschnittliche Erfolg für die drei Fragmente lag bei 75,7%. Insgesamt 18 Holzproben aus Indonesien mit Querschnittsdurchmessern von 19,0 bis 32,0 cm wurden vergleichend untersucht hinsichlich der DNA Menge und Qualität in Extrakten der verschiedenen Zonen des Holzes: Splintholz (a), Übergangszone von Splint- zu Kernholz (m) und Kernholz (i). Das Ergebnis zeigt, daß: 1) Die DNA Menge im Verlauf vom Kernholz zum Splintholz zunimmt. 2) Das Ausmaß des Zerfalls der DNA vom Splintholz zum Kernholz größer wird. 3) Der Gehalt an PCR Hemmstoffen vom Kernholz zum Splintholz zunimmt.

Forest destruction and degradation (deforestation) remain major threats to the global biodiversity and cause enormous environmental damage in particular in tropical regions, where the highest density of species is accommodated. One third of global deforestation was caused by logging, in which more than 50% was illegally done (Brack, 2003). Dipterocarpaceae ( dipterocarps ) is a species-rich tree family distributed over the tropical belt of three continents of South America, Africa and Asia. Dipterocarps predominate the international tropical timber market (trade names: meranti, balau for Shorea spp., keruing for Dipterocarpus spp., kapur for Dryobalanops, etc.), and therefore play an important role in the economy of many Southeast Asian countries. However, in many regions dipterocarps are critically endangered due to forest destruction and non-sustainable forest management. Many activities have been initiated by government or non-government organizations to fight illegal! logging. Several associations of wood-product manufacturers have released policy statements, in which member companies are committed to sourcing their wood or timber from legal and well-managed forests. Therefore, the development of tools to test the origin of wood particularly to check the plausibility of statements concerning the origin of wood from a certain forest enterprise is required. Molecular genetic methods can be useful to infer species identity and are promising tools to control the geographic origin of logged timber. Molecular genetic methods can be useful to infer species identity and are promising tools to control the geographic origin of logged timber. Two basic conditions need to be met in order to apply molecular genetic methods: First, protocols need to be developed to extract DNA in sufficient quantity and quality from unprocessed or processed wood. Second, diagnostic DNA markers need to be identified, i.e., genetic inventories with a high spatial resol! ution. The objective of this research is to establish DNA extr! action m ethods for wood of Dipterocarpaceae. This research was started by the test of several published DNA isolation methods and commercial kits for extraction of DNA from several processed and unprocessed woods. Wood extracts were then analyzed by PCR amplification to confirm the success of DNA isolation. The optimized DNeasy Plant Mini Kit (Qiagen) method reported in Rachmayanti et al. (2006) is considered as the most efficient method. This method is considered simple, due to its size (small scale procedure) and its applicability to be carried out in a standard equipped genetic laboratory. Nevertheless it gives an adequate DNA quality & quantity for PCR amplification and other down stream molecular methodologies such as DNA genotyping, cloning and sequencing. The addition of polyvinylpyrrolidone (PVP) into the lysis buffer is an important step in this method, since it could reduce PCR inhibition significantly. Wood of different species, types (unprocessed and processed), regi! onal origin and condition were analyzed in this study. A total of 406 wood samples consisting of 332 dipterocarp woods and 74 non-dipterocarp woods were analyzed. A study of chloroplast DNA markers showed that successful amplification was achieved in 369 out of 406 PCR reactions (90.9%) for the short fragment (ccmp2, approximately 150 bp), in 319 out of 406 reactions (78.6%) for the middle length fragment (trnL, approximately 600 bp) and in 234 out of 406 reactions (57.6%) for the long fragment (trnLF, approximately 1,100 bp). Thus, the average success rate for the three fragments was 75.7%. A total of 18 wood samples from Indonesia with disk diameters between 19.0 until 32.0 cm were included in the comparative study of DNA quantity and quality in extracts of different wood zones: outer rings of sapwood (a), rings in the transition zone between sapwood and heartwood (m) and inner rings of heartwood (i). The results show that: 1) DNA quantity is increasing along the wood reg! ions from inner heartwood to outer sapwood; 2) DNA degradation! level i ncreases from outer sapwood to inner heartwood; 3) The content of PCR inhibitory substances is increasing from the inner heartwood to the outer sapwood.