Fruiting body development of Coprinopsis cinerea: Cytology and regulatory factors

Coprinopsis cinerea, der wollstielige Tintling, ist ein saprotropher essbarer Basidiomycet, der natürlicherweise auf Pferdemist wächst. Trotz seines guten Nährstoffgehaltes reduziert die arttypische schnelle Autolyse der Hüte des Pilzes während seiner Reifung einen potenziellen Verbrauchswert. Auf dem Gebiet der Wissenschaft dient der Pilz seit mehr als einem Jahr-hundert als ausgezeichneter Modellpilz für Studien über sexuelle Prozesse und Kreuzungs¬typen von Pilzen, Entwicklungsprozesse des Fruchtkörpers, Hyphenwachstum mit asexueller Sporulation (Oidiation) von primären und sekundären Myzelien (sterile Monokaryen und fertile Dikaryen), Physiologie und allgemeine Genetik bei Basidiomyceten. Die Entwicklung des Fruchtkörpers in C. cinerea erfolgt an Dikaryen (Myzel nach Paarung zweier kompatibler Monokaryen) bei 25 °C und folgt einem konservierten Schema, das durch Tag- und Nachtphasen definiert ist, mit gut vorhersagbaren definierten Stadien über die Zeit. Es dauert insgesamt sieben Tage, um den Prozess der Fruchtkörperentwicklung zu vollenden. Der Differenzierungsprozess beginnt mit der Bildung von anfänglichen Hyphenaggrega¬ten, die primäre Hyphenknoten (Pks) genannt und am Tag 0 der Entwicklung im Dunkeln erzeugt werden, gefolgt darauf von der Bildung lichtinduzierter kompakter Aggregate am Tag 1, die als sekundäre Hyphenknoten (Sks) bezeichnet werden und anschließend in ihrem Innern primor¬di-a¬les Stiel- und Hutgewebe differenzieren. Wenn kein Lichtsignal empfangen wird, werden die Pks in vielzellige Dauerstadien, sogenannte Sklerotien, ausdifferenziert, anstatt sich in licht-induzierte Fruchtkörper zu entwickeln. Die Primordiumentwicklung von Sks über die primor-dialen Stadien P1 bis P5 dauert fünf Tage, um dann am 6. Tag der Entwicklung in Karyogamie und Meiose innerhalb der Basidien mit anschließender Basidiosporenproduktion zu gipfeln, die parallel zur Fruchtkörperreifung (Stielstreckung und Hutöffnung) verläuft. Reife Fruchtkörper autolysieren ihre Hüte am Tag 7 des Standardentwicklungs¬weges, um die Basidio¬sporen in zu Boden fallenden flüssigen Tröpfchen freizusetzen. Primordien von C. cinerea sind komplexe vielzellige Strukturen, in denen die Bildung, Dif¬fe-renzierung und Degeneration verschiedener Arten von Zellen und Geweben im Laufe der Entwicklung stattfinden, um aus einem einfachen Hyphenknoten eine vollständige komple¬xe vielzellige Fruchtkörperstruktur zu bilden. Ein solcher Fruchtungsprozess wird in strikter Weise durch ver¬schie¬dene Umwelt- und genetische Faktoren gesteuert, die einen direkten Einfluss auf die ablaufenden morphologischen Entwicklungen des Pilzes haben. Trotz umfangreicher Unter-su¬chungen in der Vergangenheit sind die biologischen Grundlagen für die komplexe Viel¬zellig-keit des Pilzes noch weitgehend unbekannt. Der sequenzierte selbstkompatible homokaryo¬ti¬sche Stamm AmutBmut wurde in dieser Arbeit für Untersuchungen eingesetzt. Der Stamm ist für klassische Genetik und molekular durch DNA-Transformation von im Licht produzierten asexuellen Sporen (Oidia) gut zugänglich. Durch Mutationen in den beiden Kreuzungstyporten A und B imitiert der genetisch einheitliche Stamm ein Dikaryon und kann daher Fruchtkörper produ¬zie¬ren, ohne sich mit einem sexuell-kompatiblen Monokaryon paaren zu müssen. Indivi-du¬elle Gene des Prozesses der Fruchtentwicklung können somit in einem einheitlichen haploiden Hintergrund untersucht werden. Die Forschung dieser Arbeit konzentriert sich auf das Verständnis der Komplexität bei der Bildung von Fruchtkörpern unter Verwendung von histochemischen und mikroskopischen Tech¬niken. Die Studie liefert detaillierte morphologische Beschreibungen der anfänglichen Hyphenknotenstadien, und der folgenden verschiedenen primordialen Stadien (P1 bis P5), die weiter zur Bildung eines reifen Pilzes führen und die hinsichtlich ihres Zeitpunkts und ihrer Morphologie genau definiert wurden. Typischerweise werden innerhalb einer normalen Kultur Hunderte von Sks ini¬tiiert. Während der weiteren Entwicklungsprozesse geben in jeder Phase wesentliche Antei¬le an Strukturen ihre Entwicklung auf und nur wenige reifen am Ende zu vollständigen geöff¬ne¬ten Fruchtkörpern. Abortive Strukturen unterscheiden sich von den sich noch weiter¬ent¬wickelnden aktiven Strukturen durch leicht graugefärbte und trocken erscheinen-de Hüte im Vergleich zu leicht rosafarbenen und frisch wirkenden Hüten, die Flüssigkeit aus-scheiden können. Um die komplexen zytologischen Prozesse während der laufenden Ent¬wick-lung von Stiel- und Hut¬geweben zu verstehen, wurden die aktiven Primordienstadien P1 bis P5 identifiziert, geern¬tet und für eine erste Proteom-Pilotstudie bereitgestellt, mit der eine Reihe von Proteinen nachgewiesen wurden, von denen bekannt ist, dass sie zu bestimmten Entwick¬lungs-schritten bei¬tragen. Ferner wurden Flüssigkeitströpfchen, die von aktiv wachsenden Primor¬dien ausge¬schie¬den wurden, gesammelt und für eine Proteomanalyse bereitgestellt, die in ihnen viele sekretierte Proteine mit potenziellen Abwehrfunktionen gegen Bakterien, Pilze, Kleintiere und Viren entdeckte. In dieser Studie wurde außerdem untersucht, wie Umweltfaktoren wie Licht und Dunkelheit sowie Belüftung und CO2 den gesamten Fruchtkörperentwicklungsprozess steuern. Änderun-gen dieser Faktoren können die normalen Phänotypen der Primordienstadien im Standard¬frucht-körperentwicklungsweg verändern. Im Dunkeln und unter erhöhter CO2-Konzentration bildet Homo¬ka¬ryon AmutBmut als Wildtyp-Stamm sogenannte „dark stipes“ mit verlängerten Stielen und unterentwickelten Hüten. Vier Mutanten mit den Genen dst1, dst2, dst3 und dst4 produzieren solche abnormalen Stiele unter Standardfruchtungsbedingungen und wurden in ihrer Morphologie analysiert. dst1 und dst2 sind UV- und REMI-Mutanten mit bekannten Defekten im WC1-Photorezeptor bzw. in einer FAD/FMN-haltigen Dehydrogenase. Diese Mutanten sind im Sk-Stadium blind und bilden „dark stipes“ unter Standardfruchtungs¬be¬din-gun¬gen und sie sind blind in Bezug auf den Verlust der lichtinduzierten Oidiation. Die UV-Mutante 7K17 (dst3) und die REMI-Mutante B1918 (dst4) von Homokaryon AmutBmut wiesen „dark stipe“-Defekte auf, die die Bildung abnormaler Stiele in der Entwicklungskette in den Stadien P3 bzw. P4 initiieren, wobei die „dark stipes“ dann später in den Zeitpunkten der Stadien P4 und P5 zu sehen sind. Die Lichtregulation der Oidia-Produktion war degegen in der Mutante B1918 normal und auch in der Mutante 7K17 noch aktiv, jedoch mit geringerer Wirksamkeit, was darauf hinweist, dass diese Mutanten per se nicht blind waren. Die Sequen-zie¬rung ihrer Genome identifizierte jeweils zwei interessante Mutationen in diesen Stämmen, die mit dem TCA-Zyklus (Tricarbonsäurezyklus) zusammenhängen, in der Pyruvat¬dehydroge¬nase (PDH) und der Acetolactat-Synthase (ILV2) in Stamm 7K17 und in einer Citrat-Synthase und in der Untereinheit CSN5 des Cop9-Signalosoms in Stamm B1918. Beide Mutanten sind daher möglicherweise im Einspeisen von Acetyl in den TCA-Zyklus blockiert. Das Cop9 (für „constitutive photomorphogenesis 9“) Signalosom koordiniert Licht- und Atmungsaktivitäten mit pilzlichen Entwicklungsprozessen und ist in allen Eukaryoten konserviert. Ein weiterer Schwerpunkt in dieser Arbeit lag auf Genen, die an der Initiierung des Frucht-körper¬entwicklungsweges und der Bildung von Primordiengewebe beteiligt sind, speziell auf einer spezifischen Familie von NWD2-Genen für kleine NTPasen. NWD2-Gene codieren für Proteine mit einer NACHT-Domäne, einer evolutionär konservierten Domäne, die der Signal-übertragung dient und nach vier verschiedenen Arten von P-Loop-NTPasen benannt ist, die in Tieren und Pilzen gefunden werden (NAIP, CIITA, HET-E und TP1). Bei einer Suche im Genom wurden in C. cinerea insgesamt 36 verschiedene NWD2-Gene gefunden, die in einem phylogenetischen Baum aller kodierten NWD2-Proteine in sieben verschie¬denen Unter¬gruppen (A bis G) clustern. Nur wenige andere einzelne Agaricomyceten (Amanita muscaria, Agaricus bisporus, C. cinerea, Galerina marginata, Gymnopus luxurians, Hebeloma cylindrosporum, Hypho¬¬loma sublateritium, Hypsizygus marmoreus, Laccaria amethystina, Moniliophthora roreri und Laccaria bicolor) besitzen Familien mit ähnlichen Genen, während die codierten Proteine in phylogenetischen Analysen in artspezifischer Weise grup¬pTie¬ren. Dementspre¬chend haben Duplikationen und Modifikationen von Genen von NWD2-Proteinen innerhalb der Pilzarten stattgefunden. Vorhandensein transponierbarer Ele¬men¬te, Positionen der dupli¬zier¬ten Gene in den nicht konservierten Regionen von Chromo¬somen in der Nähe von Telomeren und die Akkumulation einer höchsten Anzahl von solchen Genen im kürzesten, wenig konservierten und wahrscheinlich jüngsten Chromosom von C. cinerea zusammen mit einer nicht konservierten Verteilung in einigen anderen Pilzarten deuten auf einen horizontalen Gentransfer während der Evolution auf der Ebene der Artenentstehung hin. In früheren Arbeiten wurde durch Transformation festgestellt, dass ein spezifisches NWD2-Gen aus Unter¬gruppe A einen Defekt in der Initiation der Fruchtkörper¬bil¬dung und andere ungewöhnliche Phänotypen in einer pkn-defekten Mutante Proto159 unterdrückt. Diese Mutante, die nach Protoplastierung von Oidien des Stammes AmutBmut und ihrer Regene¬ra¬tion isoliert wurde, kann keine Pks produzieren, hat ein langsameres und dünneres Myzel¬wachstum als das Eltern-Homokaryon AmutBmut und färbt den Agar mit submersem Myzel von Kulturen braun. In dieser Studie veränderte die Einführung anderer NWD2-Gene der Untergruppe A durch Transformation verschiedentlich die mutierten Mycel-Eigenschaften in der Mutante Proto159, blockierten verschiedentlich die Braunfärbung des submersen Myzels und des Agars und, in dieser Arbeit sehr wichtig, induzierten verschiedentlich die Bildung von primären Hyphen¬kno¬ten und Sklerotien im vegetativen Myzel und führten auch zur Herstellung von Fruchtkörpern.

Coprinopsis cinerea, the gray shagged ink-cap, is a saprotrophic edible basidiomycete that naturally grows on horse dung. Despite richness in nutrients, the typical fast autolysis of the cap of the mushroom during maturation lowers the potential consumption value. In the field of science, for more than a century the fungus served as an excellent model mushroom for studying fungal sex and mating types, the fruiting body developmental process, hyphal growth with asexual sporulation (oidiation) on primary and secondary mycelia (sterile monokaryons and fertile dikaryons), physiology and general genetics in basidiomycetes. Fruiting body development in C. cinerea takes place on dikaryons (mycelia after mating of two compatible monokaryons) at 25 °C and follows a conserved scheme defined by day and night phases, with well predictable distinct stages over the time. It thus takes 7 days to complete the fruiting pathway. The differentiation process starts with the formation of initial hyphal aggregations called primary hyphal knots (Pks) generated in the dark on Day 0 of the fruiting pathway, followed by light-induced compact aggregates, termed secondary hyphal knots (Sks) on Day 1 in which subsequently primordial stipe and cap tissues differentiate. When no light signal is received, Pks will be differentiated into multicellular dormant resting bodies called sclerotia instead of developing into a light-induced fruiting body. Primordium development starting from Sks over the stages P1 to P5 takes five days to culminate on Day 6 of development in karyogamy and meiosis within the basidia and subsequent basidiospore production which parallels fruiting body maturation (stipe elongation and cap expansion). Mature fruiting bodies autolyze on Day 7 of the standard fruiting pathway to release the basidiospores in liquid droplets to the ground. Primordia of C. cinerea are the complex multicellular structures during which the formation, the differentiation and the degeneration of various types of cells and tissues take place over the time of development to form a complete and complex multicellular fruiting structure from a simple hyphal knot. Such a fruiting process is strictly controlled by various environmental and genetic factors that have a direct influence on the morphological characteristics of the fungus. Despite extensive work in the past, it is still mostly unknown what constitutes the complex multicellularity of the fungus. The self-compatible homokaryotic strain AmutBmut with an established genome sequence was used to conduct the experiments in this thesis. The strain is well accessible to classical and molecular genetics, by transformation of asexual spores (oidia) produced in light. By mutations in the two mating-type loci A and B it mimics a dikaryon and is therefore able to fruit without mating to another compatible monokaryon. Individual genes in the process of fruiting bogy development can thus be studied in a throughout homogenic haploid background. This research focuses on understanding the complexities in fruiting body formation, using histochemical and microscopy techniques. The study provides detailed morphological descriptions on the initial hyphal knot stages and the different primordial stages (P1 to P5) which proceed to form a mature mushroom were exactly defined regarding time scale and morphology. Within a typical culture, hundreds of Sks are initiated. During the further developmental processes, at every stage substantial parts of structures abandon in development and only few reach fruiting body maturation. Abortive structures with slightly grayish dry caps can be distinguished from continuing structures by pinkish, fresh looking caps excreting liquid. Furthermore, to understand the complex cytological processes during stipe and cap development, fresh ongoing stages P1 to P5 primordia were identified, harvested and provided for a first proteome pilot study that detected many proteins known to contribute to specific steps in the development. Further, liquid droplets excreted from the actively growing primordia were collected and provided for a proteomic analysis which revealed within the droplets many secreted proteins with potential defense functions against bacteria, fungi, small animals and viruses. This study in addition examined how environmental factors such as light and dark, and aeration and CO2 control the entire fruiting process. Changes in these factors can alter the normal phenotypes of the primordial stages in the standard fruiting pathway. In the dark and under increased CO2, homokaryon AmutBmut as wildtype strain will form so-called “dark stipes” with length-extended stipes and underdeveloped caps. Four mutants in genes dst1, dst2, dst3 and dst4 produce such dark stipes under standard fruiting conditions and were analyzed in morphology. dst1 and dst2 are UV and REMI mutants and were already known to have defects in the WC1 photoreceptor and a FAD/FMN-containing dehydrogenase, respectively. These mutants are blind at the Sk stage and form dark stipes under standard fruiting conditions and are also blind with respect to loss of light-induced oidiation. UV mutant 7K17 (dst3) and REMI mutant B1918 (dst4) of homokaryon AmutBmut have dark stipe defects initiating formation later in the development at the stages P3 and P4, respectively, with dark stipes seen at the stages P4 and P5. However, light regulation of oidia production was normal in mutant B1918 and also still active in mutant 7K17 but with lower effectivity, indicating that these mutants were not per se blind. Whole-genome sequencing identified each two interesting mutations in these strains related to TCA (tricarboxylic acid) cycle, in pyruvate dehydrogenase (PDH) and acetolactate synthase (ILV2) in 7K17 and in a citrate synthase and in subunit CSN5 of the Cop9 signalosome in B1918. Both mutants, therefore, are possibly blocked in feeding acetyl into the TCA cycle. The Cop9 (for constitutive photomorphogenesis 9) signalosome coordinates light and respiratory activities with developmental processes and is conserved in all eukaryotes. A further focus was given to genes participating in initiation of the fruiting pathway and primordial tissue formation, with a specific family of NWD2 genes for small NTPase. NWD2 genes encode proteins with a NACHT domain, an evolutionarily conserved domain that serves in signal transduction and is named after four different types of P-loop NTPases found in animals and fungi (NAIP, CIITA, HET-E, and TP1). Genome searches in C. cinerea found in total 36 different NWD2 genes which cluster into 7 different subgroups (A to G) in an evolutionary tree of all the encoded NWD2 proteins. Few other individual Agaricomycetes (Amanita muscaria, Agaricus bisporus, C. cinerea, Galerina marginata, Gymnopus luxurians, Hebeloma cylindrosporum, Hypholoma sublateritium, Hypsizygus marmoreus, Laccaria amethystina, Moniliophthora roreri, and Laccaria bicolor) from different families have related genes while their proteins cluster in species-specific manner. Accordingly, duplication and modification of genes of NWD2 proteins have taken place within the fungi. Presence of transposable elements, location of the duplicated genes in the unconserved regions of chromosomes close to telomeres and accumulation of a maximum number of genes in the C. cinerea shortest, little conserved and likely youngest chromosome together with the random distribution in a few other fungal species suggest horizontal gene transfer during evolution at the level of speciation. In previous studies, one specific NWD2 gene from subgroup A was found by transformation to suppress the fruiting defect and other unusal phenotypes in a pkn defective mutant Proto159. This mutant, was isolated of AmutBmut after protoplasting and regeneration of oidia, is unable to produce Pks, has a slower and thinner mycelial growth than homokaryon AmutBmut and stains the agar with submerged mycelium of cultures brown. The introduction of other NWD2 genes of subgroup A into mutant Proto159 by transformation in this study variably altered mutant mycelial properties, blocked the brown staining of submerged mycelium and the agar, and, most importantly, induced primary hyphal knot and sclerotia formation in the vegetative mycelium and also lead to the production of fruiting bodies.

2022-04-18