Novel approaches to diagnose, classify, and treat subclinical and clinical mastitis in dairy cows | Neue Ansätze zur Diagnose, Klassifizierung und Behandlung subklinischer und klinischer Mastitis bei Milchkühen

The objectives of this thesis were (1) to utilizes a dynamometer and a handheld infrared thermometer to diagnose and classify clinical and subclinical mastitis (Publication I), (2) to evaluate the biomarker cathelicidin, milk amyloid A, and haptoglobin to diagnose and classify clinical and subclinical mastitis (Publication II), and (3) to study the advantage of an additional application of the non-steroidal anti-inflammatory drug flunixin in treatment of clinical mastitis using parameter of Publication I and II (Additional unpublished data). In times of ongoing automatization of dairy cow husbandry, objective and reliable methods, are highly in demand. Analyzing specific biomarkers in milk or using tools such as the handheld dynamometer or infrared thermography (IRT) could be advantageous compared to subjective or semi-quantitative criteria such as palpation of the udder in clinical mastitis (CM) cases or evaluation of SSC using cow side tests (e.g., California Mastitis Test) in subclinical mastitis (SCM) quarters. To reduce antimicrobial resistance and economic losses, a treatment of cows with Non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAIDs) not only in severe, but also in mild and moderate CM seems to be advantageous. The first study investigated the diagnostic value of a handheld dynamometer and an infrared thermometer to diagnose and score CM and SCM and to compare those values with results from palpation of the udder tissue. Overall, data of 218 cows with CM (i.e., 46 mild, 106 moderate, and 66 severe cases), 142 with SCM, and 68 healthy cows were enrolled. Data provides evidence that the dynamometer is an accurate diagnostic tool to differentiate between healthy and mastitic udder quarters. The severity score of CM could be determined by using the dynamometer. Threshold for udder firmness to detect quarters with CM was 1.002 kg. Using a threshold of 1.175 kg in CM quarters, it was possible to differentiate between negative and positive bacteriological results. A differentiation between healthy and CM quarters with IRT was possible, albeit UST were highly influenced by ambient temperature. We were able to show, that UST increased up to 0.18°C for each degree of ambient temperature. The objective of the second study was to investigate the diagnostic value of three biomarkers, i.e., cathelicidin (CATH), milk amyloid A (MAA), and haptoglobin (HP) for the diagnosis of SCM and CM. Furthermore, the accuracy of these biomarkers to differentiate between mild, moderate, and severe CM and the influence of different pathogens on biomarker levels was tested. A total of 67 healthy cows, 119 cows with SCM, and 212 cows with CM were enrolled in the study. While CATH, MAA, and HP were measured in all samples from healthy cows and those with SCM, HP, and CATH results were only available from 121 cows with CM. Milk amyloid A was measured in all samples. In cows with CM, the mastitis quarter and a second healthy quarter, serving as a healthy in-cow-control quarter were sampled. Several different generalized linear mixed models were used to determine the effect of the health status of the udder quarter (e.g., healthy, SCM, CM and healthy in-cow control) different severity scores (e.g., mild, moderate, and severe) and bacteriological results on CATH, MAA, and HP levels. Furthermore, receiver operating characteristic curves were calculated to establish thresholds between different udder healthy status or different bacteria. A differentiation between healthy quarters, quarters with SCM, and CM was possible, using all three biomarkers. Thresholds for CATH to differentiate between healthy quarters and quarters with SCM or CM were 0.000 NOD450 (Se = 0.83, Sp = 0.97) and 0.053 NOD450 (Se = 0.98, Sp = 0.99), respectively. Thresholds of 1.28 μg/mL (Se = 0.65, Sp = 0.76) and 1.81 μg/mL (Se = 0.77, Sp = 0.83) for MAA and 3.65 μg/mL (Se = 0.92, Sp = 0.94) and 5.40 μg/mL mL (Se = 0.96, Sp = 0.99) for HP were also calculated, respectively. Healthy in-cow control quarters from cows with mastitis showed elevated MAA and HP levels compared to healthy quarters from healthy cows. Only the level of MAA was higher in severe CM cases compared to mild ones. In contrast to CM, CATH, and HP in SCM quarters were significantly influenced by different bacteriological results. Additional unpublished data were presented in this thesis evaluating whether the application of transdermal flunixin influences cure rates of mild, moderate, or severe CM. Udder firmness measured by dynamometer, levels of the two different biomarker CATH and MAA in milk and bacteriological examination were used to evaluate curing. To be able to compare the curing success, we examined all animals after initially examination on day 1 (D1) the following 4 days (D2 - D5), on day seven (D7) and on day 21 (D21). During these examinations, udder firmness and levels of biomarkers were measured. Two quarters per cow were examined, the mastitic quarter and a healthy in-cow control quarter. In addition, a bacteriological examination of the milk was carried out on D5 and D21 to determine bacteriological cure. Data of udder firmness was available for all enrolled 218 cows (i.e., 46 mild, 106 moderate, 66 severe) for all examination days. For the evaluation of level of biomarker CATH and MAA 121 cows (20 cows with mild, 63 with moderate, and 38 with severe clinical mastitis) could be evaluate. For MAA, data from D1 - D5 and D21 of additional 24 cows (7 cows with mild, 7 with moderate, and 10 with severe clinical mastitis) were available. After examination on D1 mild or moderate CM were treated either with transdermal flunixin or with placebo, severe CM with transdermal flunixin or injected meloxicam, respectively. An udder quarter was considered cured, if the original mastitis causing pathogen of D1 was no longer detectable on D5 or D21, respectively. In mild or moderate CM, there was no significant difference of udder firmness differences and level of CATH between animals treated with transdermal flunixin and those treated with placebo throughout days of examination. Only on D2 and D3 level of biomarker MAA was lower in mastitis quarter in cows treated with transdermal flunixin instead of placebo. Cows, which were treated with transdermal flunixin showed a higher bacteriological cure rate than untreated control cows. Interestingly, all cows treated with transdermal flunixin instead of placebo had a negative bacteriological result on D21. In severe CM, transdermal flunixin and meloxicam treated animals showed similar results in udder firmness difference, level of MAA and CATH, and bacteriological curing. Overall, this thesis demonstrates that the udder health status of dairy cows can be accurately and objectively classified using (1) a dynamometer that measures udder firmness at the udder or (2) biomarkers (CATH, MAA and HP) in the milk. Furthermore, some of investigated parameters (e.g., udder firmness, CATH, and MAA) can be used to objectively evaluate the cure of clinical mastitis.

Ziel dieser Arbeit war es, den Einsatz eines Dynamometers und eines Infrarotthermometers (Publikation I) sowie der Biomarker Cathelicidin, Milch-Amyloid A und Haptoglobin (Publikation II) zur Diagnose und Klassifizierung von subklinischen und klinischen Mastitiden unterschiedlichsten Schweregrades zu validieren. Zusätzlich sollte die ergänzende Anwendung des transdermal applizierten Nicht-steroiden Antiphlogistikums Flunixin bei der Behandlung von klinischen Mastitiden unterschiedlichen Schweregrades bewertet werden (Additional Unpublished Data). In Zeiten der fortschreitenden Automatisierung in der Milchviehhaltung sind objektive und verlässliche Methoden sehr gefragt. Die Analyse spezifischer Biomarker in der Milch oder die Verwendung von Instrumenten wie dem Dynamometer oder dem Infrarotthermometer könnte, im Vergleich zu den bisher verwendeten subjektiven oder semi-quantitativen Methoden der Palpation des Euters bei klinischen Fällen, oder der Bewertung von somatischer Zellzahl (SCC) mittels California Mastitis Test (CMT) bei subklinischen Fällen von Mastitis, vorteilhaft sein. Um die Resistenzen von Antibiotika und die wirtschaftlichen Kosten zu reduzieren, scheint sich eine Behandlung der Mastitiskühe mit Nicht-steroidalen Antiphlogistika (NSAIDs), nicht nur bei hochgradiger, sondern auch bei gering- und mittelgradigen Mastitiden, positiv auf die Heilung von Mastitiden auszuwirken. In der ersten Studie wurde der diagnostische Wert eines portablen Dynamometers und eines Infrarotthermometers untersucht, um klinische und subklinische Mastitiden zu diagnostizieren und zu klassifizieren. Erhobene Werte wurden mit den Ergebnissen aus einer palpatorischen Untersuchung des Euters verglichen. Insgesamt wurden Daten von 218 Kühen mit klinischer Mastitis (46 gering-, 106 mittel- und 66 hochgradige), 142 mit subklinischer Mastitis und 68 gesunde Kühe ausgewertet. Unsere Daten zeigen, dass mithilfe eines Dynamometers zwischen gesunden Eutervierteln und solchen mit subklinischer oder klinischer Mastitis unterschieden werden kann. Die Einteilung des Schweregrads von klinischen Mastitiden ist mit einem Dynamometer ebenso möglich. Der Grenzwert für die Euterfestigkeit zur Erkennung von Vierteln mit klinischen Mastitiden lag bei 1,002 kg. Mit dem Grenzwert von 1,175 kg in Vierteln mit klinischer Mastitis war es möglich, zwischen Eutervierteln mit negativen und positiven bakteriologischen Befunden zu unterscheiden. Eine Unterscheidung zwischen gesunden Vierteln und solchen mit klinischer Mastitis mithilfe des Infrarotthermometers war zwar möglich, allerdings hing die Euteroberflächentemperatur stark von der Umgebungstemperatur ab. Wir konnten zeigen, dass die Euteroberflächentemperatur mit jedem Grad steigender Umgebungstemperatur bis zu 0,18°C zunahm. Ziel der zweiten Studie war es, den diagnostischen Wert der drei Biomarker Cathelicidin (CATH), Milch-Amyloid A (MAA) und Haptoglobin (HP) für die Diagnose von subklinischen und klinischen Mastitiden zu untersuchen. Darüber hinaus wurde die Eignung dieser Biomarker zur Unterscheidung zwischen gering-, mittel- und hochgradiger klinischer Mastitis und der Einfluss verschiedener Erreger auf ihre Konzentration getestet. Insgesamt wurden 67 gesunde Kühe, 119 Kühe mit subklinischer und 212 Kühe mit klinischer Mastitis in die Studie aufgenommen. Während CATH, MAA und HP in allen Proben von gesunden Kühen und Kühen mit subklinischer Mastitis gemessen wurde, lagen Ergebnisse von CATH und HP nur für 121 Kühe mit klinischer Mastitis vor. In allen Proben wurde MAA gemessen. Bei Kühen mit klinischer Mastitis wurde das Viertel mit Mastitis und ein zweites, gesundes Viertel, das als gesundes Kontrollviertel einer Kuh diente, beprobt. Verschiedene generalisierte lineare Modelle wurden berechnet, um den Einfluss des Gesundheitszustands eines Euterviertels (gesund, subklinische Mastitis, klinische Mastitis und gesundes Kontrollviertel), verschiedener Schweregrade klinischer Mastitiden (gering-, mittel- und hochgradig) und verschiedener bakteriologischer Erreger auf CATH-, MAA- und HPKonzentration zu bestimmen. Darüber hinaus wurden Grenzwerte für Euter mit unterschiedlichem Eutergesundheitsstatus oder unterschiedlichem Mastitiserreger berechnet. Eine Unterscheidung zwischen gesunden Vierteln und Vierteln mit subklinischer oder klinischer Mastitis war unter Verwendung aller drei Biomarker möglich. Der Grenzwert für CATH zur Unterscheidung zwischen gesunden Vierteln und Vierteln mit subklinischer oder klinischer Mastitis lag bei 0,000 NOD450 (Se = 0,83, Sp = 0,97) beziehungsweise bei 0,053 NOD450 (Se = 0,98, Sp = 0,99). Die Grenzwerte für MAA lagen bei 1,28 μg/ml (Se = 0,65, Sp = 0,76) und 1,81 μg/ml (Se = 0,77, Sp = 0,83) und für HP bei 3,65 μg/ml (Se = 0,92, Sp = 0,94) und 5,40 μg/ml (Se = 0,96, Sp = 0,99). Gesunde Kontrollviertel von Kühen mit klinischer Mastitis wiesen im Vergleich zu gesunden Vierteln von gesunden Kühen erhöhte MAA- und HP-Konzentrationen auf. Nur die Konzentration von MAA war bei hochgradigen klinischen Mastitiden höher als bei geringgradigen Mastitiden. Im Gegensatz zu klinischen Mastitisvierteln, wurden CATH- und HP- Konzentrationen in subklinischen Vierteln durch unterschiedliche bakteriologische Befunde signifikant beeinflusst. Die „Additional Unpublished Data“ dieser Arbeit zeigen Daten zur Behandlung von klinischen Mastitiden und bewerten, ob die Anwendung des transdermal applizierten Flunixins einen Effekt auf die Heilung von gering-, mittel- oder hochgradigen klinischen Mastitiden hat. Hierzu wurden Entzündungszeichen des Euters und der Milch gemessen. Bei der Bestimmung der Euterfestigkeit kam ein Dynamometer zum Einsatz. In der Milch wurde die Konzentration verschiedener Biomarker (CATH und MAA) bestimmt. Des Weiteren fand eine bakteriologische Untersuchung der Milch statt. Um den Heilungserfolg vergleichen zu können, wurden alle Kühe nach der Aufnahmeuntersuchung am Tag 1 (D1), an den folgenden 4 Tagen (D2 - D5), am Tag 7 (D7) und am Tag 21 (D21) untersucht. Bei diesen Untersuchungen wurde die Euterfestigkeit gemessen und Milchproben zur späteren Untersuchung der Konzentration der Biomarker genommen. Pro Kuh wurden zwei Viertel untersucht, das erkrankte Viertel und ein gesundes Kontrollviertel. Darüber hinaus wurde eine bakteriologische Untersuchung der Milch an D5 und D21 durchgeführt, um die bakteriologische Heilung des Mastitisviertels zu bewerten. Daten zur Euterfestigkeit lagen für alle ausgewerteten 218 Kühe (46 Kühe mit gering-, 106 Kühe mit mittel- und 66 Kühe mit hochgradiger klinischer Mastitis) für alle Untersuchungstage vor. Für die Bewertung der Biomarker CATH und MAA konnten 121 Kühe (20 Kühe mit gering-, 63 Kühe mit mittel- und 38 Kühe mit hochgradiger klinischer Mastitis) ausgewertet werden. Für MAA lagen Daten von D1 - D5 und D21 von weiteren 24 Kühen (7 Kühe mit gering-, 7 Kühe mit mittel- und 10 Kühe mit hochgradiger klinischer Mastitis) vor. Nach der Untersuchung an D1 wurden Kühe mit gering- und mittelgradigen klinischen Mastitiden entweder mit transdermalen Flunixin oder mit einem Placebo behandelt. Kühe mit hochgradiger klinischer Mastitis bekamen transdermales Flunixin oder injiziertes Meloxicam. Ein Euterviertel galt als geheilt, wenn der ursprünglich verursachende Erreger von D1, an D5 oder D21 nicht mehr nachweisbar war. Bei gering- und mittelgradigen klinischen Mastitiden gab es innerhalb der gesamten Untersuchungstage keinen signifikanten Unterschied zwischen den mit transdermalen Flunixin und den mit Placebo behandelten Tieren hinsichtlich der Differenz der Euterfestigkeit und CATH-Konzentration. Nur an D2 und D3 war die Konzentration von MAA im Mastitisviertel bei den mit transdermalem Flunixin behandelten Kühen niedriger als bei Kühen, die mit Placebo behandelt wurden. Kühe, die mit transdermalem Flunixin im Gegensatz zum Placebo behandelt worden waren, wiesen darüber hinaus sowohl am D5 als auch am D21 eine höhere bakteriologische Heilungsrate auf. Interessanterweise hatten alle Kühe, die mit transdermalem Flunixin anstatt eines Placebos behandelt wurden, am D21 ein negatives bakteriologisches Ergebnis. Bei schweren klinischen Mastitiden zeigten die mit transdermalen Flunixin oder mit Meloxicam behandelten Tiere ähnliche Ergebnisse der Differenzen von Euterfestigkeit, der Konzentration von CATH und MAA und der bakteriologischen Heilung. Insgesamt präsentiert diese Arbeit, dass der Eutergesundheitsstatus von Milchkühen mit Hilfe (1) eines Dynamometers, das die Euterfestigkeit am Euter misst, oder (2) den Biomarkern (CATH, MAA und HP) in der Milch, genau und objektiv klassifiziert werden kann. Außerdem lässt sich mit einigen der untersuchten Parameter (z.B. Euterfestigkeit, CATH und MAA) objektiv die Heilung von klinischen Mastitiden bewerten.