Diagnóstico laboratorial de Sarcocystis spp. em bovinos | Laboratorial diagnosis of Sarcocystis spp. in cattle

Serological tests are frequently performed to confirm Sarcocystis spp. infection and they also are suitable to evaluate a large number of samples. Molecular tests provide detection and characterization of species. Therefore, the aims of the study were: (1) investigate Sarcocystis spp. infection in cattle hearts through direct microscopic examination, polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) and DNA sequencing (2) detect Sarcocystis spp. infection in cattle through direct microscopic examination, confirm sarcocysts identity by PCR and evaluate and correlate these results with the serological diagnosis of cattle by indirect immunofluorescence (3) compare indirect imunnofluorescence (IFAT) and Dot-Blot method for serological diagnosis of Sarcocystis spp. in experimentally infected mice and detect serological cross-reactions with N. caninum and T. gondii. Chapter 1 of this thesis presents a study that myocardium samples were collected from 314 bovine in an abattoir and analyzed for the occurrence of sarcocysts by light microscopy. Sarcocysts isolated from 134 of these hearts were submitted to DNA extraction and PCR. PCR-amplified DNA fragments were digested with the restriction enzymes BclI and RsaI aiming the differentiation among S. cruzi, S. hirsuta, and S. hominis and the identified Sarcocystis species was confirmed by DNA sequencing. Sarcocysts were detected in all bovine myocardium samples. PCR-RFLP and DNA sequencing resulted in identification of S. cruzi. In the study presented in Chapter 2, myocardium and blood samples from 50 adult beef cattle were collected from a slaughterhouse. Each myocardium was submitted to fresh microscopic examination for investigation of compatible cysts to Sarcocystis spp. Ten sarcocysts were collected of each sample and processed to DNA extraction followed by PCR for molecular diagnosis of Sarcocystis spp. The presence of antibodies against the parasite was tested by IFAT in the blood serum. The frequency of sarcocysts detection by fresh examination was 100% (50/50). Specific antibodies against Sarcocystis spp. were detected in 96% (48/50) and 80% (40/50) of serum samples examined at 1:25 and 1:200 dilutions, respectively. DNA from Sarcocystis spp. was amplified by PCR in 86% (43/50) of the collected cysts. The methods employed allowed to detect the infection by Sarcocystis spp. and RIFI showed good sensitivity compared to fresh microscopic examination. In the study presented in Chapter 3, serological tests (RIFI and Dot-blot) of mice inoculated with Sarcocystis spp. or N. caninum or T. gondii. Dot-Blot showed same specificity and sensibility as IFAT for immunological diagnostic of Sarcocystis spp. in experimentally infected mice and this immunoblot test did not demonstrate serological cross-reactions with N. caninum and T. gondii.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Testes sorológicos são frequentemente utilizados para confirmar a infecção por Sarcocystis spp. e também são úteis para avaliação de um grande número de amostras. Testes moleculares proporcionam a detecção e caracterização de espécies de Sarcocystis. Portanto, os objetivos deste estudo foram: (1) investigar a infecção por Sarcocystis spp. em corações de bovinos, através de exame microscópico direto, reação em cadeia pela polimerase (PCR), polimorfismo no comprimento do fragmento de restrição (PCR-RFLP) e sequenciamento de DNA; (2) investigar a infecção por Sarcocystis spp. em bovinos pelo exame microscópico direto, confirmar a identidade dos sarcocistos por PCR e avaliar e correlacionar seus resultados com o diagnóstico sorológico dos bovinos pela imunofluorescência indireta; (3) comparar a imunofluorescência indireta (RIFI) e método de Dot-Blot para diagnóstico sorológico de infecção por Sarcocystis spp. em camundongos experimentalmente infectados e detectar possíveis reações sorológicas cruzadas com N. caninum e T. gondii. No Capítulo 1 desta tese apresenta-se um estudo no qual amostras de miocárdio de 314 bovinos foram coletadas de um frigorífico e analisados quanto a ocorrência de sarcocistos por microscopia óptica. Sarcocistos isolados de 134 destes corações foram submetidos à extração de DNA e PCR. O DNA amplificado foi digerido com enzimas de restrição BclI e RsaI para diferenciação entre S. cruzi, S. hirsuta e S. hominis. A espécie de Sarcocystis identificada foi confirmada por sequenciamento de DNA. Sarcocistos foram detectados em todas as amostras de miocárdio de bovinos avaliadas. A PCR-RFLP e sequenciamnto de DNA resultaram na identificação de S. cruzi. No estudo apresentado no Capítulo 2 foram coletadas amostras de miocárdio e sangue de 50 bovinos adultos de um frigorífico. Cada miocárdio foi submetido a exame microscópico a fresco para pesquisa de cistos compatíveis com Sarcocystis spp. Dez sarcocistos foram coletados de cada amostra e processados para extração de DNA seguida de PCR para diagnóstico molecular de Sarcocystis spp. A presença de anticorpos contra o parasito foi testada pela RIFI no soro sanguíneo. A frequência de detecção de sarcocistos pelo exame a fresco foi de 100% (50/50). Anticorpos específicos contra Sarcocystis spp. foram detectados em 96% (48/50) e 80% (40/50) das amostras de soro testadas na diluição de 1:25 e 1:200, respectivamente. DNA de Sarcocystis spp. foi amplificado pela PCR em 86% (43/50) dos cistos coletados. Os métodos empregados permitiram detectar a infecção por Sarcocystis spp. e a RIFI mostrou uma sensibilidade satisfatória em comparação com exame microscópico a fresco. No estudo apresentado no Capítulo 3, foram realizados exames sorológicos (RIFI e Dot-blot) de camundongos inoculados com Sarcocystis spp. ou N. caninum ou T. gondii. Dot-Blot demonstrou mesma sensibilidade e especificidade que a RIFI para diagnóstico sorológico de Sarcocystis em camundongos experimentalmente infectados e este teste não demonstrou reação sorológica cruzada com N. caninum e T. gondii.