Procariotas residentes de filoplano do feijoeiro como agentes de biocontrole de enfermidades da parte aérea da cultura | Bean phylloplane resident prokaryotes as biocontrol agents of aerial diseases

O Brasil é o principal produtor de feijão no mundo, com mais de três milhões de toneladas produzidas anualmente. Entretanto, esta produtividade poderia ser maior. Diversos fatores têm impedido que a produção do país aumente, entre eles, a ocorrência de doenças durante o ciclo da cultura tem papel central. Mais de duzentos patógenos já foram relatados ocorrendo em feijoeiro, embora apenas uma dúzia tenha sido relatada como importante. No Brasil, o crestamento bacteriano, a mancha angular, a ferrugem e a antracnose são as principais doenças da parte aérea da cultura, podendo reduzir a produção em até 70%. Atualmente, as medidas de controle adotadas têm sido relativamente eficientes devido à alta variabilidade dos patógenos no campo e pequeno número de genes de resistência disponíveis e o plantio das mesmas cultivares por ciclos sucessivos. Assim o controle biológico tem papel fundamental, quando inserido numa estratégia de manejo integrado de doenças. Dentre os organismos estudados para atuarem no biocontrole de doenças, as bactérias têm sido relatadas como capazes de inibir outros microrganismos por meio de mecanismos de antibiose, parasitismo, competição e indução de resistência. O presente trabalho teve como objetivos selecionar bactérias do filoplano de feijoeiro como agentes de biocontrole de doenças da parte aérea da cultura, baseado em estratégias de seleção conjuntas in vitro e in vivo, determinar que mecanismos de controle poderiam estar envolvidos, se os isolados obtidos estariam atuando como promotores de crescimento ou indutores de resistência e testar a efetividade dos isolados em campo, em diferentes cultivares e em idades diferentes da cultura, contra os patógenos desafiantes, Colletotrichum lindemuthianum, Erysiphe polygoni, Phaeoisariopsis griseola, Pseudomonas viridiflava, Uromyces appendiculatus e Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli. Dos 500 isolados obtidos, três foram mais promissores, quanto ao controle das doenças em casa de vegetação, reduzindo a severidade das doenças quando comparados ao tratamento com água, sendo dois identificados por sequenciamento do RNA16S como Bacillus cereus (UFV-75 e UFV-172) e o terceiro, por análise de ácidos graxos, como Pseudomonas putida (UFV-108). Nos ensaios de antibiose in vitro, verificou-se que a bactéria Bacillus cereus (UFV-75) foi capaz de inibir, seja a germinação de conídios ou o crescimento micelial de fungos ou o crescimento de bactérias, todos os patógenos testados. Demonstrou-se em ensaio in vitro que B. cereus (UFV-75) foi produtor de sideróforos, compostos voláteis, bacteriocinas e da enzima quitinase. As bactérias B. cereus (UFV-172) e P. putida (UFV-108) também produziram sideróforos, embora o isolado UFV-172 não tenha inibido o crescimento de nenhum dos patógenos in vitro. Nos ensaios de campo, UFV-75, UFV-108 e UFV-172, reduziram a severidade da mancha angular (P. griseola) e da ferrugem (U. appendiculatus). Nos ensaios de promoção de crescimento, o isolado UFV-74 (Pseudomonas putida) foi selecionado, por promover o aumento do tamanho das folhas e das plantas em casa de vegetação e também aumentar a produtividade no campo, quando pulverizado sobre as folhas ou via microbiolização de sementes. Nos testes com produtos comerciais, B. cereus (os dois isolados) e P. putida foram sensíveis apenas aos fungicidas Cupravit Azul Br e Manzat 800. Nos ensaios de amplitude de controle, onde se avaliou a eficiência de B. cereus (UFV-172 e UFV-75) e P. putida, em controlar: a) o crestamento bacteriano em plantas da cultivar Pérola com idades diferentes; b) a antracnose, o oídio, a mancha bacteriana e a mancha angular na cultivar Pérola e; c) em nove cultivares diferentes contra o crestamento bacteriano, todos os três isolados foram eficientes em controlar o crestamento bacteriano comum em plantas com idades até 60 dias após a emergência. Todos os isolados foram capazes de reduzir a severidade da antracnose, do oídio, da mancha bacteriana e da mancha angular, exceto nos ensaios de UFV-75 X oídio e todos os isolados foram eficientes em controlar o crestamento bacteriano, em todas as cultivares testadas, exceto nos ensaios de UFV-75 X ‘Vermelhinho’. Nos ensaios de sistemicidade, onde buscava-se determinar se B. cereus (UFV-172) poderia estar atuando como indutor de resistência sistêmica, o isolado inibiu os patógenos desafiantes X. a. pv. phaseoli e M. incognita, quando aplicado em região separada espacialmente da região que foram aplicados os patógenos, dando indícios de que o isolado pode estar agindo nas plantas de feijoeiro como indutor de resistência. Esse resultado é corroborado pelo ensaio de restrição de multiplicação de X. a. pv. phaseoli, quando o isolado foi aplicado quatro dias antes do patógeno e esse, quando infiltrado em folhas de feijoeiro, teve um desenvolvimento inferior ao de plantas não expostas ao isolado, sugerindo que mecanismos de sinalização que induzem a síntese de compostos que restringem o desenvolvimento dos patógenos são desencadeados nas plantas quando estas são expostas ao isolado e que esse sinal é sistêmico sendo translocado das folhas até as raízes.

Brazil is the most important bean producer in the world, producing around 3 million tons of grains per year. Nevertheless, the Brazilian productivity could be higher but several factors have been impeding increases in productivity such as the occurrence of multiple diseases during the plant life cycle. In this sense, more than two hundred pathogens are known to induce diseases in bean but only a few actually are important. Under Brazilian conditions, the bacterial blight, the angular leaf spot, the rust and the anthracnose are the most important bean phylloplane diseases and may account for losses up to 70% if environmental conditions favor disease occurrence. Nowadays, the majority of disease control procedures lack efficiency due to inefficiency of available recommended chemicals in the field, the high level of variability in pathogen populations as well as the few resistance genes detected and manipulated. Therefore, biological control assumes paramount importance when included in global procedures of disease integrated management. Among focused microorganisms as potential biocontrol agents, bacteria have been exhaustively investigated and it is well known that they can act either by direct antibiosis or by inducing systemic resistance. This work had as main objective the selection of prokaryotic phylloplane residents that might act as agents of biological control for bean aerial part diseases, from a universe of 500 isolates obtained from healthy bean phylloplane. In this sense, the strategy of combining “in vitro” as “in vivo” procedures for the massal screen, the investigation on the nature of control mechanisms involved, specific tests to determine whether the observed biocontrol could be attributed to direct antibiosis or to induced resistance, specific assays to verify whether selected antagonists might act as growth promoters, field tests to investigate whether selected isolates would act as biocontrol agents when delivered to distinct bean cultivars, to plants in different phenology stages and against multiple pathogens (Xanthomonas axonopodis pv. phaseoli, Pseudomonas viridiflava, Uromyces appendiculatus, Colletotrichum lindemuthianum, Phaeoisariopsis griseola and Erysiphe polygoni) were studied. Out of the set of 500 isolates, three of them - UFV-75, UFV-172 (Bacillus cereus) and UFV-108 (Pseudomonas putida) – presented the best performance as biocontrol agents being able to reduce diseases severity up to 75% in greenhouse tests. In “in vitro” tests, isolate UFV-75 was able to inhibit growth of all pathogens as well as produce siderophores, volatile antimicrobial compounds, bacteriocins and chitinases. Isolates UFV-172 and UFV-108 also produced siderophores but the latter shown no “in vitro” activity against pathogens. In field trials, all three isolates showed efficiency for reducing severity of rust (U. appendiculatus) and angular leaf spot (P. griseola). In growth-promoting assays, an isolate distinct from the ones selected as biocontrol agents, namely UFV-74 (Pseudomonas putida), behaved as a good promoter, as detected by plant growth parameters evaluation like number of leaves, plant height and seed production, if delivered either by seed microbiolization or by spraying of propagules in the aerial part. Investigating the possibility of mixing the selected biocontrol agents and commercial products recommended in Brazil (registered pesticides, like fungicides, insecticides and herbicides) for the bean culture, it was found that all of them were sensitive only to the fungicides Cupravit Azul Br and Manzat 800. Using X. a. pv. phaseoli as challenging pathogen, it was found that all of them were able to low down disease severity but in the interaction isolate UFV-75 and “Vermelhinho” cultivar. All three selected isolates were able to promote the experimental biocontrol of bacterial blight under controlled conditions regardless plant age, up to 70 days after sowing. Using “Perola” as model cultivar, it was verified that protection brought about by the three isolates had character of multiplicity in the sense that this protection was effective against a broad range of pathogens like C. lindemuthianum, P. griseola P.viridiflava and Erysiphe polygoni. In protection sistemicity assays, the isolate UFV-172 provided protection against X. a. pv. phaseoli and Meloidogyne incognita even if delivered to locals remote from the site of inoculation. This constitutive sistemicity of protection indicates that isolate UFV-172 may promote biocontrol by inducing systemic resistance and the efficiency by which the antagonist restricted multiplication of a model pathogen (X. a. pv. phaseoli) in bean leaf tissue provided an additional evidence for that.

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