PL: Izolacja, hodowla i charakterystyka mezenchymalnych komórek macierzystych izolowanych z rąbka rogówki i ich potencjalne zastosowanie w okulistyce weterynaryjnej | EN: Isolation, culture and characterization of mesenchymal Stem cells isolated from the corneal limbus and their potential use in veterinary ophthalmology

abstractPL: Przeszczep rąbkowych komórek macierzystych LMSC jest obiecującą metodą leczenia uszkodzeń rogówki. Alternatywnym źródłem komórek macierzystych do regeneracji powierzchni oka są mezenchymalne komórki macierzyste (MSC). Komórki te można stosunkowo łatwo otrzymać w wystarczającej ilości z różnych typów tkanek (np. szpiku kostnego, tkanki tłuszczowej) i namnażać in vitro do autologicznego zastosowania. Nie ma jednak jak dotąd bezpośrednich dowodów na to, że MSC mogą wspomagać gojenie i regenerację uszkodzonej tkanki rogówki tak skutecznie, jak specyficzne tkankowo LMSC. Znacząca część badanych terapii z wykorzystaniem MSC opierało się na miejscowym ich podawaniu bez naruszenia ciągłości ściany gałki ocznej lub na iniekcjach okołogałkowych oraz na podaniach dożylnych. Ze względu na histofizjologię rogówki okazało się, ze aplikacja MSC do wnętrza oka jest postępowaniem ryzykownym bez istotnych przewidywanych korzyści dla rogówki. Powyższe fakty oraz konieczność utrzymania odpowiednio długiego i ścisłego kontaktu transplantowanych LMSC z łożyskiem uszkodzonej rogówki powodują potrzebę zastosowania nośnika umożliwiającego przyleganie i migrację komórek. Podłoże powinno także dostarczać czynniki stymulujące wzrost jak związki organiczne czy bodźce fizyczne oraz umożliwiać dyfuzję składników odżywczych oraz innych wytwarzanych substancji, a także utrzymywać odpowiednie parametry mechaniczne i fizykochemiczne, sprzyjające integracji i dalszemu rozwojowi tkanki. Celem niniejszej pracy była ocena klinicznych i technologicznych możliwości opracowania metody pozyskiwania rąbka rogówki od psa domowego (Canis lupus familiaris) i kota (Felis catus) i ustabilizowania jednorodnej warstwy komórek macierzystych rąbka na podłożu umożliwiającym ich przeniesienie i utrzymanie na leczonej powierzchni rogówki. Założeniem było także uzyskanie szybkiej adhezji komórek do powierzchni wzrostowej niezależnie od ilości i jakości materiału, oraz uzyskanie w ciągu 72 godzin proliferujących komórek hodowli pierwotnej dla minimum 90% izolacji. Zastosowana substancja musiała spełniać wymagania prawne dla surowców farmaceutycznych. Wcześniejsze doświadczenia wskazywały na słabą adhezję izolowanych komórek i eksplantów do standardowych powierzchni wzrostowych, a proces zazwyczaj był długotrwały (około 2 tygodni) i cechował się niską powtarzalnością. Celem pracy badawczej była zatem modyfikacja powierzchni wzrostowej w celu uzyskania szybkiej adhezji eksplantów, oraz migracji komórek na powierzchnię wzrostową. W ramach prowadzonych badań uzyskaliśmy w pełni powtarzalną metodę wytworzenia prototypu preparatu inżynierii tkankowej w postaci autologicznych LMSC na membranie kolagenowej uformowanej na kształt soczewki kontaktowej gotowy do implantacji u pacjenta. Prowadzone przez nas badania wykazały, że pobrane fragmenty rąbka zawierające LCMS transportowane do laboratorium do 72 godzin stanowią dobry materiał wyjściowy do procesu izolacji i namnażania LMSC. W trakcie badań wyizolowano rąbek od 20 pacjentów; w tym 8 kotów (5 samic i 3 samce) oraz 12 psów (6 samic i 6 samców). W grupie kotów wiek dawców wahał się od 3 do 20 lat. Najmłodszy pies miał 10 miesięcy, a najstarszy 16 lat. Część dawców (8 psów i 1 kot) była w trakcie leczenia okulistycznego, które na skutek ciężkości procesu zakończyło się enukleacją. W dwóch przypadkach (l kot i 1 pies) pobrano rąbek od pacjenta bezpośrednio po mechanicznym urazie gałki ocznej. W 3 przypadkach (2 psy i 1 kot) rąbek pobrano od pacjentów z rozpoznaniem nowotworzenia w obrębie gałki ocznej. W jednym przypadku (l kot) oko, z którego pobrano rąbek nosiło cechy atrofii pozapalnej (rozległe zmiany w rogówce i zmniejszenie gałki ocznej). U jednego z kotów w chwili pobrania rąbka stwierdzano objawy zakaźnego zapalenia otrzewnej (FIP). U 4 psów stwierdzono różnego stopnia problemy kardiologiczne. U 4 dawców (4 psy) w historii leczenia występowała choroba nowotworowa bez związku z objawami okulistycznymi (u 2 psów aktywna faza choroby nowotworowej o charakterze pozaokulistycznym). Badania pozwoliły także na stwierdzenie, że możliwe jest pobranie, namnożenie i ustabilizowanie na podłożu kolagenowym LMSC pozyskanych także od pacjentów w zaawansowanym wieku oraz od pacjentów, których oko donorowe objęte było procesem chorobowym jak jaskra i rozległy wrzód rogówki. Badania wykazały, że na jakość materiału komórkowego nie miały istotnego wpływu choroby pozaokulistyczne występujące u dawców w chwili pobrania fragmentu rąbka. Kolejnym krokiem będzie wprowadzenie wytworzonego przez nas prototypu inżynierii komórkowej w ramach terapii eksperymentalnej.

abstractEN: LMSC limbal stem cell transplantation is a promising treatment for corneal damage. An alternative source of stem cells for ocular surface regeneration are mesenchymal stem cells (MSG). These cells can be relatively easily obtained in sufficient numbers from various tissue types (e.g. bone marrow, adipose tissue) and expanded in vitro for autologous use. However, there is as yet no direct evidence that MSCs can promote the healing and regeneration of damaged corneal tissue as effectively as tissue-specific LMSCs. A significant part of the studied therapies using MSCs was based on their local administration without disturbing the continuity of the eyeball wall or on periocular injections and intravenous administration. Due to the histophysiology of the cornea, it turned out that the application of MSCs into the eye is a risky procedure with no significant expected benefits for the cornea. The above facts and the need to maintain sufficiently long and close contact of the transplanted LMSCs with the damaged cornea bed result in the need to use a carrier enabling cell adhesion and migration. The substrate should also provide factors that stimulate growth, such as organic compounds or physical stimuli, and enable the diffusion of nutrients and other produced substances, as well as maintain appropriate mechanical and physicochemical parameters that favor the integration and further development of the tissue. The aim of this study was to evaluate the clinical and technological possibilities of developing a method for obtaining corneal limbus from a domestic dog (Canis lupus familiaris) and eat (Felis catus) and stabilizing a uniform layer of limbal Stem cells on a substrate enabling their transfer and retention on the treated corneal surface. The aim was also to achieve rapid cell adhesion to the growth surface, regardless of the quantity and quality of the material, and to obtain proliferating primary culture cells within 72 hours for a minimum of 90% isolation. The substance used had to meet legal requirements for pharmaceutical raw materials. Previous experiments indicated poor adhesion of isolated cells and explants to standard growth surfaces, and the process was usually long-lasting (about 2 weeks) and characterized by low repeatability. The aim of the research was therefore to modify the growth surface in order to achieve rapid adhesion of explants and migration of cells to the growth surface. As part of the research, we obtained a fully repeatable method of producing a prototype of a tissue engineering preparation in the form of autologous LMSCs on a collagen membrane formed in the shape of a contact lens, ready for implantation in the patient. Our research has shown that collected limb fragments containing LCMS, transported to the laboratory for up to 72 hours, constitute a good stalling material for the process of isolation and multiplication of LMSCs. During the study, limbus was isolated from 20 patients; including 8 cats (5 females and 3 males) and 12 dogs (6 females and 6 males). In the group of cats, the age of donors ranged from 3 to 20 years. The youngest dog was 10 months old and the oldest was 16 years old. Some of the donors (8 dogs and 1 cat) were undergoing ophthalmological treatment, which resulted in enucleation due to the severity of the process. In two cases (l cat and dog), a limb was collected from the patient immediately after a mechanical injury to the eyeball. In 3 cases (2 dogs and 1 cat), the limbus was collected from patients diagnosed with tumors within the eyeball. In one case (l cat), the eye from which the limbus was taken showed signs of post-inflammatory atrophy (extensive changes in the cornea and reduction of the eyeball). At the time of limb collection, one of the cats had symptoms of Infectious Peritonitis (FIP). Various degrees of cardiac problems were observed in 4 dogs. Four donors (4 dogs) had a history of cancer without any connection with ophthalmological symptoms (in 2 dogs there was an active phase of non-ophthalmic cancer). The research also allowed us to conclude that it is possible to collect, multiply and stabilize on a collagen substrate LMSCs also obtained from patients of advanced age and from patients whose donor eye was affected by diseases such as glaucoma and extensive corneal ulcer. The studies showed that the quality of the cellular material was not significantly influenced by nonophthalmic diseases occurring in the donors at the time of collecting the limbal fragment. The next step will be to introduce our cell engineering prototype as part Of experimental therapy.

status: finished