Development of High Accuracy Multiplex Real - time PCR Technique for Determining Sperm Sex Ratio in Dairy Bull Semen | การพัฒนาเทคนิคมัลติเพล็กซ์เรียลไทม์พีซีอาร์ที่มีความแม่นยำสูงสำหรับประเมินสัดส่วนเพศของอสุจิในน้ำเชื้อพ่อโคนม

English. Sperm sex ratio determination using PCR - based technique is widely validated on precise of X - and Y - chromosome purity in sex - sorted bovine semen. The aim of this study was to develop a technique for estimating sperm sex ratio by using a multiplex polymerase chain reaction (multiplex real - time PCR). The X and Y chromosome - specific markers, bovine proteolipid protein (PLP) gene and sex - determining region Y (SRY), were simultaneously quantified in a single tube. To quantify DNA products, Taqman probe -labeled fluorescence was used in the reaction i.e., PLP probe labeled HEX dye, and SRY probe labeled FAM dye. The reference DNA of male peripheral white blood cell (WBC) was used as a template for constructing the standard curve, which contained an equal ratio between X - chromosome and Y - chromosome. The standard curve of both PLP and SRY genes showed two linear equations for calculating the proportion of X - and Y - sperm ratio. The WBC standard curve indicated an average straight - line slope as - 3.330, representing high - efficiency (99.66 %) of the reaction to synthesize new DNA amplicons. Nine samples of bull semen, Y - sorted semen (Y = 90 %), semen samples with Y ratio in 80 %, 70 %, 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, and X - sorted semen (Y = 10 %), were prepared and quantified by using the multiplex real - time PCR technique. Two standard techniques (singleplex real - time PCR technique and multiplex droplet digital PCR technique (ddPCR)) were amplified X - and Y - chromosome specific genes and compared with the developed technique. Each sample was run in triplicate and calculated in percentage of Y sperm ratio. Results obtained from those three assays were not significantly different. Therefore, the multiplex real - time PCR assay in this study was cost - effective, reduce time - consuming, and providing an accurate estimation method.

Thai. การประเมินสัดส่วนเพศของอสุจิด้วยเทคนิคพีซีอาร์เป็นวิธีที่นิยมใช้อย่างกว้างขวางในการประเมินความบริสุทธิ์ของสัดส่วนอสุจิ X และอสุจิ Y ในน้ำเชื้อพ่อโคที่ผ่านกระบวนการคัดแยกเพศ การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อพัฒนาวิธีการประมาณอัตราส่วนเพศของอสุจิ โดยใช้ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรสแบบมัลติเพล็กซ์เรียลไทม์ (multiplex real - time PCR) ทำการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอเป้าหมายที่สนใจพร้อมกันในหลอดเดียวด้วยชุดไพรเมอร์ที่จำเพาะเจาะจงต่อยีน proteolipid protein (PLP) บนโครโมโซม X และไพรเมอร์ที่จำเพาะเจาะจงต่อยีน sex - determining region Y (SRY) บนโครโมโซม Y แสดงการเพิ่มปริมาณดีเอ็นเอผลลัพธ์เส้นใหม่ด้วยสีฟลูออเรสเซนต์ติดที่โพรบ (Taqman) โดยโพรบของยีน PLP ติดสี HEX และโพรบของยีน SRY ติดสี FAM และใช้ดีเอ็นเออ้างอิงจากเซลล์เม็ดเลือดขาวโคเพศผู้ ซึ่งมีอัตราส่วนของโครโมโซม X และโครโมโซม Y ที่เท่ากัน สร้างเป็นกราฟเส้นตรงมาตรฐาน จากการศึกษาได้กราฟเส้นตรงมาตรฐานของยีน PLP และ ยีน SRY แสดงสมการเชิงเส้นสองสมการสำหรับคำนวณอัตราส่วนอสุจิ X และอสุจิ Y โดยมีค่าความชันเฉลี่ยของกราฟเส้นตรงทั้งสองเท่ากับ - 3.330 แสดงถึงปฏิกิริยาที่มีประสิทธิภาพสูงในการสร้างดีเอ็นเอเส้นใหม่ (ร้อยละ 99.66) ทดสอบความแม่นยำของการประเมินสัดส่วนเพศอสุจิด้วยเทคนิค multiplex real - time PCR ในตัวอย่างน้ำเชื้อพ่อโคนมจำนวน 9 ตัวอย่าง ได้แก่ น้ำเชื้อคัดเพศผู้มีอสุจิ Y ร้อยละ 90 ตัวอย่างน้ำเชื้อที่มีอสุจิ Y สัดส่วนร้อยละ 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20 และตัวอย่างน้ำเชื้อคัดเพศเมียมีอสุจิ Y ร้อยละ 10 ตามลำดับ เปรียบเทียบผลการคำนวณสัดส่วนอสุจิด้วยเทคนิคมาตรฐานสองเทคนิคคือ  ซิงเกิลเพล็กซ์เรียลไทม์พีซีอาร์แบบแยกหลอด (singleplex real - time PCR) และเทคนิคมัลติเพล็กซ์ดรอปเล็ตดิจิทัลพีซีอาร์ (multiplex droplet digital PCR) ซึ่งแต่ละตัวอย่างถูกทดสอบจำนวนสามซ้ำ แสดงผลการคำนวณเป็นร้อยละของอสุจิ Y จากการเปรียบเทียบผลการประมาณอัตราส่วนเพศอสุจิ พบว่า ทั้งสามเทคนิคสามารถคำนวณสัดส่วนเพศได้ถูกต้องใกล้เคียงกับตัวอย่างที่ทราบค่าที่เตรียมไว้และได้ผลการคำนวณสัดส่วนของอสุจิ Y ใกล้เคียงกันทั้งหมด โดยไม่มีความแตกต่างทางสถิติ ดังนั้น เทคนิค multiplex real - time PCR ที่ได้พัฒนาขึ้นในการศึกษานี้จึงคุ้มค่า ประหยัดเวลา และให้ผลการประเมินสัดส่วนเพศที่แม่นยำ