[Development and application of thechnologies for the detection of Botrytis cinerea Pers.based on immunological and molecular techniques] | Desarrollo y aplicacion de metodologias para la deteccion de Botrytis cinerea Pers.basadas en tecnicas inmunologicas y moleculares

Spanish; Castilian. Se realizo un ensayo inmunoenzimatico basado en el sistema biotina-estreptavidina (ELISA-Biotina-Estreptavidina o ELISA-B-EA). Se inmovilizo el antigeno en placas de microtitulacion y seguidamente se agrego un anticuerpo monoclonal anti-botrytis (BC12.CA4), un segundo anticuerpo biotinilado y un conjugado compuesto por estreptavidina mas fosfatasa alcalina. Mediante medicion de absorbancia, el ensayo logro detectar hasta 90 ng del hongo. En la busqueda de tecnicas de una mayor sensibilidad en la deteccion del antigeno, se realizo una purificacion de un fragmento de ADN que se utilizo como marcador para los ensayos ELISA-Digoxigenina (ELISA-DIG) e lnmuno-Reaccion en Cadena de la Polimerasa (Inmuno-PCR). Este fragmento de 980 pb se purifico desde un fragmento Hindlll del bacteriofago lambda (Gibco BRL), y se biotinilo a traves de una amplificacion por PCR con partidores biotinilados (I03s y I04as). El fragmento se denomino lambda-980b. Para el ensayo ELISA-DIG el fragmento lambda-980b se marco con digoxigenina. Luego en placas de microtitulacion se inmovilizo el antigeno y se adiciono el anticuerpo monoclonal, el segundo anticuerpo biotinilado, y la estreptavidina. Posteriormente se agrego lambda-980b conjugado con digoxigenina. Para la deteccion de la digoxigenina se adiciono a cada pocillo un anticuerpo F(ab)2 anti-DIG conjugado a peroxidasa. Se midio la absorbancia de la reaccion colorimetrica a 405 nm. El metodo ELISA-DIG presento una sensibilidad similar al metodo ELISA-B-EA. El metodo de Inmuno-PCR se desarrollo sobre la misma base inmunologica de las tecnicas anteriores, empleando tubos de polipropileno. En este caso, el lambda-980b marco al complejo antigeno-anticuerpo y haciendo uso de partidores internos (cfl1 y cfl2) se amplifico por PCR un segmento de 590 pb visualizandose por electroforesis en gel de agarosa. Bajo las condiciones del ensayo, el lnmuno-PCR no se logro implementar para la deteccion de antigeno de B. cinerea