Identification and cloning of antifungal gene: Enzyme activity of chitinase, growth pattern and RNA synthesis of Trichoderma harzianum

English. Fungal diseases cause a significant decrease on estate crops yields. Oil palm basal stem rot caused by Ganoderma sp. leaf rust disease on arabica caused by Hemillia vastatrix, and cocoa and rubber wilts by Phytophthora spp. which are the most important fungal disease on estate crops. The chemical control of those plant disease is considered ineffective, and could give negative impact to the environment. Therefore, genetic engineering for disease resistant plants through transformation of resistance genes becomes one of the prospective solution. Non-pathogenic fungi such as Trichoderma sp. and Gliocladium sp. are known as biofungicides due to their enzymatic activities of chitinase and Beta-1.3 glucanase that have the ability to hydrolize pathogenic fungal cell walls. For the purpose of identification and cloning antifungal gene, construction of cDNA library is an important preceding step for which availability of good RNA is indispensable. In this experiment, kinetics growth and total RNA synthesis of T. harzianum in liquid culture (PDB) were studied. The activity of chitinase from T. harzianum grown on PDB media with or without chitin was not significantly different. The result showed that the total RNA content significantly increased 48 hours after inoculation and reached the highest result on the 72-hour cultures. These kinetic data is an important information to select Trichoderma culture as sources for the total RNA and mRNA isolations

unknown. Beberapa cendawan patogen dapat menyebabkan penurunan hasil yang cukup nyata pada tanaman perkebunan. Ganoderma sp. penyebab busuk pangkal batang pada kelapa sawit, Hemilia vastatrix yang menyebabkan penyakit karat daun pada kopi arabika, dan Phytophthora spp. penyebab layu pada kakao dan karet merupakan jenis cendawan penyebab penyakit utama tanaman perkebunan tersebut. Pengendalian penyakit tanaman secara kimiawi terbukti tidak memberikan hasil yang memuaskan serta dapat membahayakan kelestarian lingkungan. Oleh karena itu rekayasa genetika tanaman untuk ketahanan terhadap penyakit melalui transformasi gen ketahanan menjadi salah satu solusi terbaik. Beberapa cendawan non-patogen seperti Trichoderma sp. dan Gliocladium sp. diketahui dapat berfungsi sebagai biofungisida karena memiliki aktivitas enzim kitinase dan Beta-1,3 glukanase yang mampu merusak komponen dinding sel cendawan patogen. Dalam upaya identifikasi dan kloning gen antifungal, pembuatan pustaka cDNA merupakan tahapan yang penting, kualitas dan kuantitas RNA yang baik dengan demikian menjadi persyaratan utama. Dalam penelitian ini pertumbuhan massa dan sintesis total RNA dari isolat Trichoderma harzianum diamati pada beberapa tingkat umur pada kultur cair (PDB). Aktivitas enzim kitinase dari T. harzianum yang ditumbuhkan pada media PDB dengan atau tanpa kitin menunjukkan hasil yang tidak berbeda nyata. Hasil pengamatan menunjukkan bahwa kandungan total RNA yang meningkat cukup tajam di mulai umur 48 jam dan tertinggi dicapai antara 72 dan 96 jam. Hal tersebut merupakan sumbangan informasi yang berarti dalam penentuan umur isolat Trichoderma untuk mengisolasi total RNA dan mRNA-nya