Cloning and sequence analysis of tomato cpDNA fragments: towards developing homologous chloroplast transformation vectors

English. With the view of developing chloroplast transformation vectors based on homologous targeting regions for tomato (Lycopersicon esculentum L.), plastid DNA fragments of tomato cv. IAC-Santa Clara were cloned and analyzed. Isolation and cloning of PstI/SalI chloroplast fragments into the pBlueScript vectors yielded the plasmids pIJB1 and pIJB2 with cpDNA fragments of 8.6 kb and 6.4 kb, respectively. DNA sequencing and computer analyses revealed that the tomato sequences cloned display from 93 to 100 % of identity to the respective fragments in tobacco, which is more pronounced in coding regions. The intergenic spacers are somewhat less conserved suggesting that evolutionary divergences occurred mainly in these putative non-coding regions. The most remarkable difference found is a 437 bp sequence present in tobacco chloroplast genome in the intergenic region of the genes trnE and trnT but completely absent in the tomato chloroplast DNA. Analysis of restriction enzyme digestion patterns revealed several unique restriction sites in the intergenic spacer regions suggesting potential utility of these sequences in species-specific vector construction for tomato chloroplast transformation.

Portuguese. Visando o desenvolvimento de vetores homólogos de transformação de cloroplastos para tomate (Lycopersicon esculentum L.), fragmentos cloroplastidiais de tomate cv. IAC-Santa Clara foram clonados e analisados. Isolamento e clonagem de fragmentos PstI/SalI de cloroplastos de tomate deram origem aos plasmídios pIJB1 e pIJB2, contendo fragmentos de 8,6 pb e 6,4 pb respectivamente. Seqüenciamento e análise dos fragmentos revelaram que as seqüências apresentam de 93 a 100 % de identidade com os respectivos fragmentos em tabaco nas regiões codificadoras. Espaços intergênicos mostraram-se menos conservados, sugerindo que divergências evolutivas ocorreram principalmente em regiões não diretamente envolvidas na tradução. A diferença mais marcante encontrada está em um fragmento de 437 pb presente em tabaco na região intergênica entre os genes trnE e trnT, mas ausente no DNA cloroplastidial de tomate. Análise do padrão de restrição das seqüências cloroplastidiais apontou sítios únicos de restrição, sugerindo potencial uso dessas seqüências para a construção de vetores de transformação de cloroplastos. O recente sucesso na expressão de genes exógenos de interesse agronômico em cloroplastos de plantas sugere que essa tecnologia promete revolucionar o conceito e a aplicação da engenharia genética no melhoramento de plantas.