New strategy for Pinus pinaster genomic library construction in bacterial artificial chromosomes | Nueva estrategia para la construcción de una genoteca genómica de Pinus pinaster en cromosomas artificiales de bacterias

Spanish; Castilian. Para poder conocer la estructura y organización de los genomas vegetales es necesario la clonación molecular de grandes fragmentos de secuencias genómicas para construir genotecas representativas. La construcción de genotecas genómicas en cromosomas artificiales de bacterias (BAC) es una de las herramientas más utilizadas con este fin y la estrategia elegida en este trabajo. Pero cuando se trabaja con especies que presentan genomas muy grandes, como el pino, realizar este tipo de genotecas es muy laborioso y costoso. En este estudio se describe un método para, a partir de cotiledones de P. pinaster, construir genotecas BAC en grupos de células, lo que disminuye drásticamente el coste, el espacio y el tiempo requerido. La genoteca BAC consta de 83 grupos de células con una media de 4000 clones por grupo y representa por ahora un 0,8 X del genoma de P. pinaster. También se demuestra que se puede realizar por PCR (reacción en cadena de la ADNpolimerasa) con rapidez la identificación del grupo que contiene un BAC de interés. Se ha identificado un grupo de células que contiene un clon BAC que porta una secuencia codificante similar a una quitinasa de clase I de Picea abies, y otro clon BAC en otro grupo que contiene secuencia homóloga a un ARNm desconocido de P. taeda. Esta estrategia permitirá rastrear y almacenar genotecas de organismos con grandes genomas y localizar en ella genes de interés con rapidez, describiéndose el método en detalle.

English. To learn about the structure and organization of plant genomes, molecular cloning of large genomic fragments for representative gene libraries construction is required. The genome library construction on bacterial artificial chromosome (BAC) is one of the most frequently used tools for this purpose, and the chosen strategy in this work. But when working with species containing very large genomes, such as pine, construction of this kind of gene libraries is a laborious and expensive task. In this study we have developed a method that starts from P. pinaster cotyledons to construct a pooled BAC library that drastically reduces cost, space and time required to clone a genotype of interest. The current BAC library comprises 83 groups of cells with an average of 4000 clones per group and accounts for a 0.8 X genome content of P. pinaster. It is also shown that a BAC of interest can be quickly identified by PCR (polymerase chain reaction): a pool containing a BAC clone that carries a coding sequence similar to a Class I chitinase of Picea abies has been identified, as well as another BAC clone in a different pool containing a sequence with homology to an unknown P. taeda mRNA. This strategy will allow screening and storing gene libraries from large genome organisms and a quickly location of genes of interest, the method been described in detail.