VCP1 Protease detection in Pochonia chlamydosporia var. catenulata Strain IMI SD 187 | Detección de proteasa VCP1 en la cepa IMI SD 187 de Pochonia chlamydosporia var. catenulata

English. The mode of action of Pochonia as a biological control agent is the penetration by means of the hyphae into the target nematode eggs. The egg shell of nematodes has an outer vitelline membrane composed mainly by proteins. Thus, hyphal penetration is the result of a physic pressure and the specific hydrolytic activity of some enzymes such as proteases and chitinases. The most important protease studied in Pochonia chlamydosporia var. chlamydosporia is VCP1. The aim of this work was to detect and characterize the protease VCP1 in a strain of P. chlamydosporia var. catenulata, a potential biological control agent for root-knot nematodes. The specific activity of this protease was tested on different culture media supplemented with protein inductors using N-succinyl-Ala-Ala-Phe-p-nitroanilide as substrate. PCR and RFLP analyses with specific primers and probes were also done. Isolates from the chlamydosporia variety were used as positive controls. The medium supplemented with chitin was the only one capable of inducing some VCP1 activity but in a low level. The VCP1-encoding gene was not detected in strain IMI SD 187 by RFLP even when the stringency conditions were reduced to the minimum possible. The low level of enzymatic activity detected by biochemical techniques does not support the presence of protease VCP1 in this strain. The low enzymatic activity reached points out to the existence of a VCP1 isoform or another different protease. These hypotheses should be proved widening the range of catenulata variety strains and taking the chlamydosporia variety (strain 10) as a reference in a comparative study with conclusive results. The results of this enzymatic characterization related to the egg infection process of host nematodes are the first achieved in a catenulata variety strain in the world.

Spanish; Castilian. El modo de acción de Pochonia como agente de control biológico es a través de la penetración de las hifas en los huevos de sus nematodos diana. La cubierta de los huevos de los nematodos posee una capa externa vitelina, compuesta en su mayoría por proteínas. Por tanto, la penetración es el resultado de una presión física y de la actividad hidrolítica específica de algunas enzimas tales como proteasas y quitinasas. La proteasa más importante del género Pochonia ha sido estudiada en la variedad chlamydosporia y es conocida como VCP1. El objetivo de este trabajo fue la detección y el estudio del comportamiento de la proteasa VCP1 en una cepa promisoria de Pochonia chlamydosporia var. catenulata. La actividad enzimática de esta proteasa se estudió en diferentes medios suplementados con inductores, empleando como sustrato N-succinil-Ala-Ala-Phe-p-nitroanilida. También se desarrollaron análisis PCR y RFLP con cebadores y sondas específicos. En todos los experimentos, los controles positivos utilizados fueron aislamientos de la variedad chlamydosporia. El medio suplementado con quitina fue el único capaz de inducir alguna actividad de la VCP1 pero en un nivel bajo. El gen que codifica para la enzima VCP1 no fue detectado por RFLP en la cepa IMI SD 187, aún cuando las condiciones de la hibridación de la sonda fueron reducidas al mínimo posible. El bajo nivel alcanzado de la actividad de esta enzima apunta hacia la existencia de una isoforma de la VCP1 u otra proteasa totalmente diferente. Esta hipótesis debe ser comprobada aumentando el rango de cepas de la variedad catenulata, teniendo como referencia la cepa 10 de la variedad chlamydosporia en un estudio comparativo con resultados conclusivos en este aspecto. Los resultados de esta caracterización enzimática relacionada con el proceso de infección de los huevos del nematodo hospedante son los primeros que se desarrollan en una cepa de la variedad catenulata, en el mundo.