Direct induced androgenesis in culture in vitro in sugar beet (Beta vulgaris L.) | Прямий індукований андрогенез у культурі in vitro буряків цукрових (Beta vulgaris L.) | Прямой индуцированный андрогенез в культуре in vitro сахарной свеклы (Beta vulgaris L.)

Ukrainian. Мета. Розробити метод прямого індукованого андрогенезу в культурі in vitro буряків цукрових. Методи. Біотехнологічні, цитологічні, селекційні, статистичні. Результати. Розроблено специфічні для буряків цукрових складники методу прямого індукованого андрогенезу в культурі in vitro, зокрема, визначено фазу розвитку мікроспор, оптимальну для ініціації андрогенезу, температурний режим передоброблення експлантів, умови культивування пиляків. За результатами цитологічного аналізу мікроспор та пилку буряків цукрових визначено, що одноядерна фаза вакуолізованої мікроспори є оптимальною для інокуляції пиляків на живильне середовище, а передоброблення експлантів із використанням низькотемпературного стресу (4–8 °С) протягом 3–15 діб є потрібним чинником, що ініціює перехід мікроспор з гаметофітного на спорофітний шлях розвитку. Розроблено склад живильних середовищ, різних за вмістом макроелементів, амінокислот, вітамінів та регуляторів росту, для культивування пиляків, ініціації процесів прямого андрогенезу та утворення ембріоїдів. За основу брали модифіковане живильне середовище Мурасіге–Скуга – 0,5 дози макроелементів з додаванням вітамінів: В1 – 10,0 мг/л; В6 – 1,0 мг/л; РР – 1,0 мг/л; С – 1,0 мг/л та амінокислот: глютамінової – 250,0–500,0 мг/л, аспарагінової – 1,0–10,0 мг/л, аргініну – 2,0–10,0 мг/л, тірозину – 1,0–10,0 мг/л, гідроксипроліну – 2,0–4,0 мг/л. За результатами досліджень визначено три найефективніші живильні середовища з різним умістом регуляторів росту: полістимулін А-6 – 1,0–3,0 мг/л за діючою речовиною + 6-БАП – 0,3–0,8 мг/л; 2,4-Д – 1,0–2,5 мг/л + 6-БАП – 0,3–0,8 мг/л + АБК – 0,3–1,0 мг/л або 6-БАП – 0,1–0,6 мг/л. Культивування пиляків буряків цукрових на розроблених живильних середовищах дало змогу отримати 0,15–1,32% андрогенних ембріоїдів різних типів та мікроклони андрогенного походження. Висновки. Розроблено метод прямого індукованого андрогенезу буряків цукрових: визначена оптимальна стадія розвитку мікроспор для інокуляції пиляків, режим температурного передоброб­лення експлантів, склад живильних середовищ для ініціації прямого андрогенезу in vitro та отримання різних типів андрогенних ембріоїдів. Результати проведеної роботи мають важливе значення для створення гаплоїдів та гомозиготних подвоєних гаплоїдних ліній, що сприятиме прискоренню селекційного процесу отримання нових сортів та гібридів буряків цукрових.

English. Purpose. To develop the method of direct induced androgenesis of sugar beet in culture in vitro. Methods. Biotechnological, cytological, breeding, statistical. Results. Specific for sugar beet components of the method of direct induced androgenesis in culture in vitro was developed, in particular, the phase of development of microspores, optimal for initiation of androgenesis, the temperature mode of explants pretreatment, conditions of anthers cultivation were determined. According to the results of cytological analysis of microspores and sugar beet pollen, it was determined that the single-nucleus stage of the vacuolized microspores is optimal for inoculation of anthers on the nutrient medium, and pre-treatment of explants using low-temperature stress (4–8 °С) for 3–15 days is a necessary factor that initiates the transition of microspores from gametophytic to sporophytic pathway of development. The composition of nutrient media, different in content of macroelements, amino acids, vitamins and growth regulators, for the cultivation of anthers, the initiation of processes of direct androgenesis and the formation of embryos have been developed. The modified Murazig-Skoog medium – 0.5 doses of macroelements with the addition of vitamins: B1 – 10.0 mg/l; B6 – 1.0 mg/l; PP – 1.0 mg/l; C – 1.0 mg/l and amino acids: glutamine – 250.0–500.0 mg/l, asparagine – 1.0–10.0 mg/l, arginine – 2.0–10.0 mg/l, tyrosine – 1.0–10.0 mg/l, hydroxyproline – 2.0–4.0 mg/liter was used as a basis. According to the results of research, three most effective nutrient media with different content of growth regulators have been determined: polystimulin A-6 – 1.0–3.0 mg/l for the active substance + 6-BAP – 0.3–0.8 mg/liter; 2.4-D – 1.0–2.5 mg/l + 6-BAP – 0.3–0.8 mg/l + ABK – 0.3–1.0 mg/l or 6-BAP – 0.1–0.6 mg/l. Cultivation of sugar beet anthers on the developed nutrient media allowed to obtain 0.15–1.32% of various types of androgen embryos and microclones of androgenic origin. Conclusions. The method of direct induced androgenesis of sugar beet is developed: the optimal stage of development of microspores for inoculation of anthers, the mode of temperature pre-treatment of explants, the composition of nutrient media for the initiation of direct in vitro androgens and the obtaining of various types of androgenic embryoids have been determined. The results of this work are important for the creation of haploids and homozygous double-haploid lines, which will accelerate the breeding process for obtaining new varieties and hybrids of sugar beet.

Russian. Цель. Разработать метод прямого индуцированного андрогенеза в культуре in vitro сахарной свеклы. Методы. Биотехнологические, цитологические, селекционные, ста­тистические. Результаты. Разработаны специфические для сахарной свеклы составляющие метода прямого индуцированного андрогенеза в культуре in vitro – определена фаза развития микроспор, оптимальная для инициации андрогенеза, температурный режим предобработки эксплантов, условия культивирования пыльников. По результатам цитологического анализа микроспор и пыльцы сахарной свеклы определено, что одноядерная фаза вакуолизированной микроспоры является оптимальной для инокуляции пыльников на питательную среду; а пред­обработка эксплантов с использованием низкотемпературного стресса – 4–8 °С в течение 3–15 суток является необходимым фактором, инициирующим переход микроспор с гаметофитного на спорофитный путь развития. Разработан состав питательных сред для культивирования пыльников, инициации процессов прямого андрогенеза и образования эмбриоидов, которые отличались по содержанию макроэлементов, аминокислот, витаминов, регуляторов роста. За основу использовали модифицированную среду Мурасиге–Скуга – 0,5 дози макроэлементов с добавлением витаминов: В1 – 10,0 мг/л; В6 – 1,0 мг/л; РР – 1,0 мг/л; С – 1,0 мг/л и аминокислот: глютаминовой – 250,0–500,0 мг/л, аспарагиновой – 1,0–10,0 мг/л, аргинина – 2,0–10,0 мг/л, тирозина – 1,0–10,0 мг/л, гидроксипролина – 2,0–4,0 мг/л. Определены три наиболее эффективные питательные среды, которые отличались содержанием регуляторов роста: полистимулин А-6 – 1,0–3,0 мг/л по действующему веществу + 6-БАП – 0,3–0,8 мг/л; 2,4–Д – 1,0 – 2,5 мг/л + 6-БАП – 0,3–0,8 мг/л + АБК – 0,3–1,0 мг/л или 6-БАП – 0,1–0,6 мг/л. Культивирование пыльников сахарной свеклы на разработанных питательных средах позволило получить 0,15–1,32% андрогенных эмбриоидов различных типов и микроклоны андрогенного происхождения. Выводы. Разработан метод прямого индуцированного андрогенеза сахарной свеклы: определена оптимальная стадия развития микроспор для инокуляции пыльников, режим предобработки эксплантов, состав питательных сред для инициации прямого андрогенеза in vitro и получения различных типов андрогенных эм­брио­идов. Результаты проведенной работы имеют большое значение для создания гаплоидов и гомозиготны удвоенных линий, что будет способствовать ускорению селекционного процеса создания новых сортов и гибридов сахарной свеклы.