Evaluación diagnóstica de fracciones cromatográficas de Fasciola hepatica mediante Western Blot y ELISA en animales infectados

Spanish; Castilian. La fasciolosis causada por Fasciola hepatica se diagnostica rutinariamente mediante el examen coprológico. Debido a que este examen no es 100% sensible y además es ineficaz en la etapa pre-patente, se realizó este trabajo con el objeto de caracterizar y seleccionar fracciones antigénicas de valor diagnóstico de extractos de excreción-secreción del parásito. Se utilizó cromatografía de exclusión por tamaño molecular (Sephacryl S-300), electroforesis en geles de poliacrilamida en ambiente reductor (SDS-PAGE) y posterior western blot (WB), además de un método de "enzyme-linked immuno-sor-bent assay" (ELISA) en microplaca. Para evaluar el valor diagnóstico de los antígenos se usaron sueros de las especies ovina, porcina y equina en tres estados (sanos, con otras parasitosis y naturalmente infectados con F. hepatica). Mediante el método cromatográfico se obtuvieron hasta 5 "peaks", que interpolados en una curva patrón representaron polipéptidos de pesos aproximados de 2.000, 400, 150, 29 y menores a 29 kDa. De éstos, los inmunorreactivos específicos para la enfermedad en las tres especies animales, bajo los criterios de SDS-PAGE y posterior WB, fueron los de 400, 150, 29 y <29. La evaluación mediante ELISA en microplaca, de estas fracciones con los sueros de las tres especies animales infectadas, indicó que la fracción de 29 kDa ofreció valores de sensibilidad y especificidad de 94.5% y 93.5%, respectivamente. Similares valores de sensibilidad y especificidad se determinaron al enfrentar esta fracción antigénica con sueros de ovinos en la etapa prepatente de la infección. Esta misma fracción analizada por el criterio de SDS-PAGE y luego por WB dio dos bandas de reconocimiento específico, una de 29 kDa y otra de 14 kDa aproximados. Con estos resultados concluimos que la fracción cromatográfica de 29 kDa sería capaz de discriminar en las especies ovina, porcina y equina, entre aquellos animales sanos, con otras parasitosis y con fasciolosis. Además fue también eficiente para diagnosticar la infección en etapa prepatente en ovinos. Por ello se constituye en una fracción promisoria para ser purificada y empleada en estudios epidemiológicos mediante ELISA

English. The antigenic components of excretory-secretory products of adult F. hepatica, were separated by gel filtration chromatography (Sephacryl S-300) and then analized by polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), followed by Western Blot (WB). In order to evaluate the sensitivity, specificity and predictive value of the selected fractions an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was used with sera from sheep, swine and horses infected with F. hepatica, as well as with control sera (uninfected animals). The chromatographic curve presented up to 5 peaks, representing polypeptides with a molecular weight of 2000, 400, 150, 29 and less than 29 kDa, according to the interpolation with a standard curve of commercial polypeptide molecular weights. The results obtained with SDS-PAGE and WB using sera from the three species, indicated that those fractions of 400, 150, 29 and <29 kDa contained polypeptides, specifically recognized only by infected animals. When these fractions were evaluated with sheep, horse and swine sera by means of ELISA, the most efficient fraction was the 29 kDa, exhibiting an average sensitivity and specificity of 94.5% and 93.5%, respectively in the three species. The SDS-PAGE and WB assay of this fraction showed the presence of two immunoreactive bands, a 29 kDa and another of 14 kDa. According to these results, it is concluded that the polypeptides contained in the 29 kDa chromatographic fraction would be suitable specific antigens, since they discriminate between infected and non infected F. hepatica animals. This fraction was also efficient in diagnosing fasciolosis in the prepatent stage of the infection in sheep. Therefore this fraction should be further studied and purified as it constitutes a prominent immunodiagnostic fraction which may be used for mass screening studies of fasciolosis using an ELISA test