Identification of phospho- and total-proteome in glioma cell lines after inhibition of cyclin-dependent kinase 12 (CDK12) and cyclin-dependent kinase 13 (CDK13)

English. Numerous factors and mechanisms control proper gene expression. Transcription regulation by RNA polymerase II (RNAPII) carboxy-terminal domain (CTD) phosphorylation influences global transcription levels and manufacture the adjustment of final RNA products. Cyclin-dependent kinases (CDKs) have been reported to be involved in the phosphorylation of RNAPII CTD. Functional disturbance of CDKs is linked to reduced regulation of transcription and disease. CDK12 and CDK13 are two of the kinases phosphorylating RNAPII CTD. Research suggests for a role of CDK12 in phosphorylating CTD Serine 2 (Ser2) for productive elongation, while the evidence of CDK13 in its role as a CTD kinase is undefined. A former student in the Pandey group, Sigrid Berg, revealed in her master thesis chromatin-bound interaction partners of CDK12. In this study we aimed to elucidate the discovered interaction partners of CDK12 in HeLa cells to acquire knowledge on its role in transcription and RNA processing events. This was performed using pulldown for CDK12 bound proteins using immuno-precipitation (IP) followed by mass spectrometry. In this part of the thesis, I set out to validate some of these interaction partners by immuno-blotting following IP under normal conditions. I was not able to detect interaction between CDK12 and interaction partners of interest, and for this cause, we chose to not proceed with this confirmation of interaction partners. Therefore, we aimed to identify the total- and phospho-proteome of glioma cell lines after inhibition of CDK12 and CDK13 using THZ531. THZ531 is a small molecule which inhibits the catalytic activity of both CDK12 and CDK13. Mass spectrometry (MS) analysis revealed multiple proteins in various intracellular regulatory pathways affected by the inhibition of CDK12/13. Earlier work carried out by the Pandey group, found that inhibition of CDK12/CDK13 specifically compromises the proliferation of glioma cells. Furthermore, earlier work has also found that CDK12/CDK13 inhibition disrupts the cell cycle of glioma cells and leads to a rapid shutdown of DNA replication. Therefore, we chose to focus on a few pathways and protein groups, including cell cycle and DNA replication. Our data indicates that inhibition of CDK12/CDK13 in glioma cells influence proteins involved in the cell cycle and DNA replication.

Flere faktorer og mekanismer kontrollerer riktig genekspresjon. Transkripsjonsregulering av RNAPII CTD fosforylering påvirker globale transkripsjonsnivåer og justerer endelig nivå av RNA-produkter. Såkalte kinaser, CDKer, er rapportert å være involvert i fosforylering av RNAPII CTD. En svekket funksjonalitet av disse CDKene er knyttet til feilregulering av transkripsjon og eventuell påfølgende sykdom. CDK12 og CDK13 er to av kinasene som fosforylerer RNAPII CTD. Forskning antyder en rolle for CDK12 i fosforylering av CTD Serine 2 (Ser2) for produktiv forlengelse, mens CDK13 sin rolle som CTD-kinase er fremdeles udefinert. En tidligere student i Pandey-gruppen, Sigrid Berg, rapporterte i sin masteroppgave flere kromatinbundne interaksjonspartnere for CDK12. I denne studien hadde vi som mål å belyse de oppdagede interaksjonspartnerne til CDK12 i HeLa-celler for å bedre forstå dens rolle i transkripsjon og RNA-prosesseringshendelser. Vi benyttet IP for å trekke ut CDK12-GFP fra cellelysatet. Western blot-analyser avslørte ikke interaksjonspartnerne av interesse, og derfor valgte vi å ikke fortsette med denne bekreftelsen av interaksjonspartnere. Videre hadde vi derfor som mål å identifisere total- og phospho-proteomet til gliomceller etter inhibering av CDK12 og CDK13 ved bruk av THZ531. THZ531 hemmer CDK12/13 sin katalytiske aktivitet. Massespektrometri (MS)-analyse avslørte flere proteiner i forskjellige intracellulære reguleringsveier som ble påvirket av inhiberingen av CDK12/13. Tidligere arbeid utført av Pandey-gruppen, fant at inhibering av CDK12/13 spesifikt kompromitterer prolifereringen av gliomaceller. Tidligere arbeid også funnet at CDK12/13-inhibering forstyrrer cellesyklusen til gliomaceller og fører til en rask shutdown av DNAreplikasjon. Derfor valgte vi å fokusere på noen få reguleringsveier og proteingrupper, inkludert cellesyklus, DNA-replikasjon og CDK2-substrater. Våre data indikerer at inhibering av CDK12/13 i gliomceller har en effekt på proteiner involvert i cellesyklusen og DNA-replikasjon.

M-BIOTEK