Callus Orchis maculata L. as a source of bioactive substances: biotechnology of cultivation | Биотехнология выращивания каллусных культур ятрышника шлемовидного – перспективного источника биоактивных веществ

Russian. Одним из востребованных в фармакологической сфере растением является Orchis maculata L., содержащий такие биологически активные вещества, как алкалоиды, флавоноиды, каротиноиды, антоцианы и стерины. На территории России данный вид занесен в Красную книгу, следовательно, актуально использовать биотехнологические методы выращивания in vitro. Проводили подбор фитогормонов в питательной среде для получения максимального прироста биомассы каллусной культуры in vitro. Объектом исследования стала 28-дневная каллусная культура Orchis maculata L., выращенная на различных питательных средах: основа среда Мурасиге-Скуга, варьирование количеством фитогормонов (от 0,1 мг до 2,0 мг): цитокинов (кинетин, 6-БАП) и ауксинов (ИМК, 2,4-Д). Из каллусных клеток, обладающих наибольшим сухим остатком, получали экстракт (экстрагент – 70% этанол, продолжительность 60 мин, температура 60 град. С, соотношение сырье:экстрагент – 1:10). Спиртовой экстракт подвергался анализу на определение качественного и количественного состава БАВ с помощью ВЭЖХ (Shimadzu LC-20 Prominence) и ТСХ (Sorbfil ПТСХ-АФ-А). Наибольший прирост биомассы каллуса наблюдается при соотношении цитокин:ауксин 1:1. На 28-е сут культивирования индекс роста 11,71+-0,01 наблюдался при использовании 6-БАП+2,4-Д (1,0 мг + 1,0 мг на 1 л), на питательной среде № 29. Наибольшее содержание сухих веществ (23,81+-0,02%) наблюдалось при использовании среды № 13: кинетин (1,5 мг)+2,4-Д (1,5 мг). Методом ТСХ в этанольном экстракте каллусных клеток (выращенных на среде № 13) было обнаружено присутствие кверцетина и кверцетин-3,7-O-бета-D-глюкопиранозидов в трисахаридной и дисахаридной форме, а методом ВЭЖХ – рутина (73,07+-3,65 мг/кг), кверцетина (15,08+-0,75 мг/кг), апигенина (23,63+-1,18 мг/кг), колеофолида (12,53+-0,63 мг/кг). На разработанной питательной среде можно получать каллусную культуру Orchis maculata L. для дальнейшего извлечения из нее фармакологически значимых биологически активных веществ.

English. Orchis maculata L. is a medicinal plant of high demand that contains alkaloids, flavonoids, carotenoids, anthocyanins, and sterols. This plant is listed in the Red Book of Russia, therefore, domestic pharmacology needs in vitro biotechnological methods for industrial cultivation of Orchis plant. The research objective was to select phytohormones in a nutrient medium that would increase the callus biomass of Orchis maculata L. The study featured callus cultures grown on various nutrient media and such phytohormones as cytokines (kinetin, 6-BAP) and auxins (BCI, 2,4-D). The amount of the phytohormones varied from 0.1 mg to 2.0 mg. The callus cells with the highest dry residue were subjected to extraction with 70% ethanol at 60 deg. С for 60 min; the ratio of raw materials : extractant was 1:10. The extract was analyzed for the qualitative and quantitative composition of biologically active substances using HPLC (Shimadzu LC-20 Prominence) and TLC (Sorbfil PTSKh-AF-A). The greatest increase in callus biomass was observed when the ratio of cytokine: auxin was 1:1. On cultivation day 14, the growth index was 7.71+-0.01 when using 6-BAP + 2.4-D (1.0 mg + 1.0 mg per 1 L) on nutrient medium No. 29. Medium No. 13, kinetin (1.5 mg) + 2,4-D (1.5 mg), provided the highest amount of dry substances (10.47+-0.02). The TLC method (medium No. 13) revealed the content of quercetin and quercetin-3,7-O-beta-D-glucopyranosides in trisaccharide and disaccharide forms. The HPLC method detected rutin (73.07+-3.65 mg/kg), quercetin (15.08+-0.75 mg/kg), apigenin (23.63+-1.18 mg/kg), and coleofolide (12.53+-0.63 mg/kg). The resulting nutrient medium made it possible to obtain enough callus Orchis maculata L. to extract biologically active substances for medicinal purposes.