Разработка методов регенерации и генетической трансформации сорта сливы Стартовая из соматических тканей | Development of methods for regeneration and genetic transformation of the commercial plum variety Startovaya from somatic tissues

Russian. Разработана эффективная методика регенерации растений из соматических тканей культурных сортов сливы домашней (Prunus domestica L.), а также схемы селекции с использованием различных репортерных (uidA, gfp) и селективных маркерных генов (nptII, hpt). При трансформации соматических тканей сорта сливы получены трансгенные растения, содержащие как репортерные гены, так и гены хозяйственно-ценных признаков. Исследовано влияние кальция пантотената на адвентивную регенерацию побегов сливы. Показано, что селективный антибиотик гигромицин является более эффективным для отбора трансформантов сливы, чем канамицин или генетицин, что выразилось в более высокой частоте трансформации – 1,2-2,2% против 0,2-0,5% при селекции на канамицине. При использовании генетицина трансгенные растения получены не были. Оптимизация условий позволила увеличить процент регенерации побегов до 79,4% для сорта Стартовая и до 39,6% для сорта Этюд. Анализ экспрессии GFP в трансгенных линиях показал, что лидерные последовательности травянистых видов растений, кодирующие сигнальные пептиды, могут быть использованы для эффективной клеточной компартментализации продуктов экспрессии гетерологичных генов в сливе. Предварительные результаты также показывают более высокий уровень экспрессии ретикулярной формы GFP в сравнении с вакуолярной и цитозольной формами. Получены 9 трансгенных линий, содержащих вставку целевого гена bar, придающего устойчивость к фосфинотрицин-содержащим гербицидам типа "Basta", что подтвердилось наличием в геноме последовательности перенесенного гена и устойчивостью полученных трансгенных растений к 3-кратной полевой концентрации гербицида "Basta".

English. An efficient technique for regeneration of plants from somatic tissues of domestic plum (Prunus domestica L.) varieties, as well as selecting schemes using various reporter (uidA, gfp) and selective marker genes (nptII, hpt) have been developed. During the transformation of somatic tissues of the commercial plum variety, transgenic plants containing both reporter genes and genes of economically valuable traits were obtained. The influence of calcium pantothenate on the adventive regeneration of plum shoots was investigated. It was shown that the selective antibiotic hygromycin is more effective for the selection of plum transformants than kanamycin or geneticin, which was expressed in a higher frequency of transformation - 1.2-2.2% versus 0.2-0.5% in selection on kanamycin. When using geneticin, transgenic plants were not obtained. Optimization of conditions made it possible to increase the percentage of regeneration of shoots to 79.4% for the 'Startovaya' variety, and up to 39.6% for the 'Etude' variety. Analysis of GFP expression in transgenic lines showed that the leader sequences of herbaceous plant species encoding signal peptides can be used to effectively cellular compartmentalization of heterologous gene expression products in the plum. Preliminary results also show a higher level of expression of the reticular form of GFP in comparison with the vacuolar and cytosolic forms. 9 transgenic lines containing an insertion of the target bar gene, which gives resistance to phosphinothricin-containing herbicides of the "Basta" type, were obtained, which was confirmed by the presence in the genome of the sequence of the transferred gene and the resistance of the obtained transgenic plants to 3-fold field concentration of the "Basta" herbicide.