Biosynthesis and biological role of coffee seed diterpenes | Biosynthèse et rôle biologique des diterpènes dans les graines de caféiers

English. Isoprenoids - or terpenoids - are the most diverse class of metabolites in plants, where they play multiple essential roles. Their various properties are also widely used by humans, especially in pharmacology. Coffee plants accumulate large amounts of ent-kaurane diterpenes, cafestol and kahweol, in the endosperm of their seeds (1-2% of dry mass). They are mainly stored in esterified form with palmitic acid or linoleic acid. Although their pharmacological properties have been extensively studied, their metabolism within the seed and their ecological role for the plant are still unknown. Through integrative approaches combining physiology, genomics and analytical chemistry, and using the chemical diversity present in the genus Coffea, the objective of this work was to contribute to the elucidation of the cafestol biosynthetic pathway and the understanding of its biological role. Several studies have shown the involvement of numerous diterpenes in the defence of plants against pests. Thus, in order to validate this hypothesis for cafestol, we tested the activity of its free and esterified forms on the growth and development of a panel of pests, including six strains of phytopathogenic fungi and two species of fruit flies. Cafestol significantly affected the mycelial growth of five of the six fungi tested, and also greatly reduced the percentage of pupation of larvae and the pupae and adult masses of one of the two flies tested, at concentrations lower than those found in coffee seeds. For all organisms tested, no effect was observed with cafestol palmitate. We also showed that diterpenes are localised in endosperm oil bodies, suggesting that esterification with fatty acids allows the accumulation of large amounts of diterpenes in a non-toxic form. Measurements of diterpenes in the seed and seedling organs during germination showed that they are transferred from the albumen to the cotyledons and then distributed to the hypocotyl and roots. Collectively, these results establish that coffee diterpenes are broad-spectrum defence compounds that protect not only the seed on the mother plant and in the soil, but also the young seedling after germination. Furthermore, the terpene synthases (TPS) and cytochromes P450 involved in cafestol biosynthesis remain unknown. Phylogenetic analyses were first carried out to identify, classify and annotate all genes coding for TPS and P450s of the coffee genome. Then, using a large transcriptomic dataset (14 coffee species and five stages of seed development per species), gene coexpression analyses highlighted the remarkable transcriptional coordination of genes involved in the metabolism of several classes of isoprenoids, in particular diterpenes and sterols, during seed development. This approach also led to the identification of candidate genes for the three steps involved in the synthesis of ent-kaurenoic acid (CPS-1, KS-2 and KO-1), and seven genes coding for P450s that could catalyse the subsequent steps of cafestol biosynthesis. The function of the seven P450 candidates was then studied by heterologous expression in yeast and tobacco, in combination with the analysis of the products obtained by chromatography coupled to mass spectrometry (GC- and LC-MS). These functional validation experiments showed the hydroxylase activity of three P450s of the CYP71 clan on ent-kaurenoic acid, which could govern its commitment into cafestol biosynthesis.

French. Les isoprénoïdes – ou terpénoïdes – sont la classe de métabolites la plus diverse chez les plantes, où ils jouent de multiples rôles essentiels. Leurs différentes propriétés sont également largement utilisées par l’homme, notamment en pharmacologie. Les caféiers accumulent de grandes quantités de diterpènes de la famille des ent-kauranes, le cafestol et le kahweol, dans l'albumen de leurs graines (1-2% de la masse sèche). Ils sont principalement stockés sous forme estérifiée à l’acide palmitique ou à l’acide linoléique. Si leurs propriétés pharmacologiques ont été largement étudiées, leur métabolisme au sein de la graine et leur rôle écologique pour la plante restent encore inconnus. À travers des approches intégratives combinant physiologie, génomique et chimie analytique, et en utilisant la diversité chimique présente au sein du genre Coffea, l’objectif de ces travaux était de contribuer à l’élucidation de la voie de biosynthèse du cafestol et à la compréhension de son rôle biologique. Plusieurs études montrent l’implication de nombreux diterpènes dans la défense des plantes contre les bioagresseurs. Ainsi, afin de valider cette hypothèse pour le cafestol, nous avons testé l’activité de ses formes libres et estérifiées sur la croissance et le développement d’un panel de bioagresseurs, comprenant six souches de champignons phytopathogènes et deux espèces de mouches des fruits. Le cafestol a significativement affecté la croissance mycélienne de cinq des six champignons testés, et a également fortement réduit le pourcentage de pupation des larves et les masses des pupes et des adultes d'une des deux mouches testées, et ce à des concentrations inférieures à celles présentes dans les graines des caféiers. Pour l’ensemble des organismes testés, aucun effet n’a été observé pour le palmitate de cafestol. Nous avons montré que les diterpènes sont localisés dans les corps lipidiques des cellules de l’albumen, suggérant que l'estérification avec les acides gras permet l'accumulation de grandes quantités de diterpènes sous une forme non toxique. Les mesures de diterpènes dans les organes de la graine et de la plantule au cours de la germination ont montré qu’ils sont transférés de l’albumen aux cotylédons, puis distribués vers l'hypocotyle et les racines. Collectivement, ces résultats établissent que les diterpènes des caféiers sont des composés de défense à large spectre qui protègent non seulement la graine sur la plante mère et dans le sol, mais aussi la jeune plantule après la germination. En outre, les terpène synthases (TPS) et les cytochromes P450 impliquées dans la biosynthèse du cafestol restent inconnues. Des analyses phylogénétiques ont d'abord été réalisées pour identifier, classer et annoter l’ensemble des gènes codant pour des TPS et des P450 du génome des caféiers. Ensuite, en mobilisant un vaste jeu de données transcriptomiques (14 espèces de caféiers et cinq stades de développement des graines par espèce) des approches de coexpression génique ont mis en évidence la forte coordination transcriptionnelle des gènes impliqués dans le métabolisme de plusieurs classes d’isoprénoïdes, notamment les diterpènes et les stérols, au cours du développement de la graine. Ces approches ont également permis d’identifier des gènes candidats pour les trois étapes permettant la synthèse de l’acide ent-kaurénoïque (CPS-1, KS-2 et KO-1), ainsi que sept gènes codant pour des P450 qui pourraient catalyser les étapes suivantes de la synthèse du cafestol. La fonction de ces sept P450 candidates a ensuite été étudiée par leur expression hétérologue dans la levure et le tabac, en combinaison avec l'analyse des produits obtenus par chromatographie couplée à la spectrométrie de masse (GC- et LC-MS). Ces travaux de validation fonctionnelle ont permis de mettre en évidence l’activité hydroxylase de trois P450 du clan CYP71 sur l’acide ent-kaurénoïque, pouvant permettre son engagement vers la synthèse du cafestol.