(trad auto)Characterization of grape microflora by FISH and PCR-TTGE methods - Application to the resolution of earthy flavors in wines | Caractérisation de la microflore des raisins par méthodes FISH et PCR-TTGE - Application à la résolution des goûts terreux dans les vins

[Departement_IRSTEA]RE [TR1_IRSTEA]TED / EPURE [Encadrant_IRSTEA]Pernelle, J.J.

English. (trad auto)In recent years, aromatic deviations qualified as earthy or mouldy have been observed in wines from several French wine-growing regions, in Beaujolais, in the Loire Valley or in Bordeaux. All types of wines can be affected. The main molecule responsible for these alterations is geosmin. It is probably produced very early in the vine, by microorganisms present on the grapes. In addition, various microorganisms are known to produce this molecule, such as actinomycetes bacteria, belonging in particular to the genus Streptomyces or moulds of the genus Penicillium. We have developed methodological tools for the simple, rapid and early detection of microorganisms responsible for the production of molecules that cause soil defects in wines. The FISH technique is used for the early detection of Streptomyces on grapes using the HGC probe. However, no Streptomyces are detected by the FISH method on our grape samples, although they are probably present, since they have been detected by conventional microbiological methods. The presence of mould spores, which are in the majority, probably masks the presence of these microorganisms. Concerning moulds, the detection of geosmine-producing species is not possible by the FISH technique due to the lack of specific probes. We have therefore developed the PCR-TTGE method for the detection of moulds present on grapes. A reference system of mould species has been set up in order to evaluate the potential of the method to discriminate between the different species present on the grapes, and to quickly identify the species present in a complex sample. The analysis of ITSI sequences makes it possible to differentiate part of the mould species from the reference frame, but comigrations occur, particularly within the genus Penicillium. This may lead to underestimating the diversity of the sample. However, the reference frame is used to assign the strips obtained in the profiles of the grape harvest samples. The application of this method to grape samples made it possible to describe the fungal flora present on their surface as a function of various factors. The variability of the microflora detected according to the wine-growing regions or the vintage is relatively limited. The most significant differences are those observed on the same plot according to maturity stage. Many species of mould are present on the grapes even if they do not show any visible alterations. The qualitative diversity of the mould species present on a plot is close from one year to the next, but environmental conditions and in particular climatic conditions lead to different quantitative balances between the species present depending on the year. The characterization of grape fungal microflora has also made it possible to isolate different strains of geosmine-producing moulds. Among these producing strains are the presence of species of the genus Aspergillus, Botrytis cinerea, and at least eight species of Penicillium. However, the earthy defect is not systematically found in wines from plots where producing species have been detected. Presumably, the presence of producing species is not a sufficient condition to systematically generate the defect in wines. Various factors probably influence the production of geosmin by the strains, such as their quantity on the grapes, their stage of development, their physiological state or the presence of certain precursor compounds. These factors remain to be studied in order to understand which parameters determine the production of geosmin on grapes.

French. Depuis quelques années, des déviations aromatiques qualifiées de terreuses ou moisies sont observées dans les vins de plusieurs régions viticoles françaises, en Beaujolais, dans le Val de Loire ou dans le Bordelais. Tous les types de vins peuvent être touchés. La principale molécule responsable de ces altérations est la géosmine. Elle est vraisemblablement produite très précocement à la vigne, par des micro-organismes présents sur les raisins. Par ailleurs, divers micro-organismes sont connus pour produire cette molécule, comme des bactéries actinomycètes, appartenant notamment au genre Streptomyces ou des moisissures du genre Penicillium. Nous avons mis au point des outils méthodologiques pour la détection simple, rapide et précoce des micro-organismes responsables de la production des molécules à l'origine des défauts terreux dans les vins. La technique FISH est utilisée pour la détection précoce des Streptomyces sur les raisins grâce à la sonde HGC. Cependant, aucun Streptomyces n'est détecté par la méthode FISH sur nos échantillons de raisins, bien qu'ils soient vraisemblablement présents, puisqu'ils ont été détectés par méthodes de microbiologie classique. La présence de spores de moisissures très majoritaires masque vraisemblablement la présence de ces micro-organismes. Concernant les moisissures, la détection des espèces productrices de géosmine n'est pas possible par la technique FISH par manque de sondes spécifiques. Nous avons donc développé la méthode PCR-TTGE pour la détection des moisissures présentes sur les raisins. Un référentiel d'espèces de moisissures a été constitué afin d'une part, d'évaluer les potentialités de la méthode pour discriminer les différentes espèces présentes sur les raisins, et d'autre part, de pouvoir identifier rapidement les espèces présentes dans un échantillon complexe. L'analyse des séquences ITSI permet de différencier une partie des espèces de moisissures du référentiel, mais des comigrations ont lieu, en particulier au sein du genre Penicillium. Cela peut conduire à sous-estimer la diversité de l'échantillon. Toutefois, le référentiel est utilisé pour assigner les bandes obtenues dans les profils des échantillons de vendanges. L'application de cette méthode à des échantillons de raisins a permis de décrire la flore fongique présente à leur surface en fonction de différents facteurs. La variabilité de la microflore mise en évidence en fonction des régions viticoles ou du millésime est relativement limitée. Les différences les plus marquées sont celles observées sur une même parcelle en fonction du stade de maturité. De nombreuses espèces de moisissures sont présentes sur les raisins même Si celui-ci ne présente pas d'altérations visibles. La diversité qualitative des espèces de moisissures présentes sur une parcelle est proche d'une année sur l'autre, mais les conditions environnementales et notamment climatiques entraînent selon l'année des équilibres quantitatifs différents entre les espèces présentes. La caractérisation de la microflore fongique des raisins a également permis d'isoler différentes souches de moisissures productrices de géosmine. Parmi ces souches productrices, on note la présence d'espèces du genre Aspergillus, de Botrytis cinerea, et d'au moins huit espèces de Penicillium. Cependant, le défaut terreux n'est pas systématiquement retrouvé dans les vins issus des parcelles où des espèces productrices ont été détectées. Vraisemblablement, la présence d'espèces productrices n'est pas une condition suffisante pour engendrer systématiquement le défaut dans les vins. Différents facteurs influencent sans doute la production de géosmine par les souches, comme leur quantité sur les raisins, leur stade de développement, leur état physiologique ou la présence de certains composés précurseurs. Ces facteurs restent à étudier afin de comprendre quels paramètres conditionnent la production de géosmine sur les raisins.