Pathological study of Tunisian isolates of Erwinia amylovora and search for apoplastic signals inducing virulence genes | Etude pathologique d’isolats tunisiens d’Erwinia amylovora et recherche de signaux apoplastiques inducteurs des gènes de virulence

English. Erwinia amylovora, the causal agent of fire blight. This pathogen, belongs to the Enterobacteriacea family. In 2012, this pathogen was identified from the north of Tunisia, where climatic conditions are favorable for the rapid development of this pathology. The first part of my thesis consisted in isolating and identifying strains of E. amylovora from different samples. The selection of twenty isolates was carried out based on the morphological aspect of the colonies, by biochemical and molecular methods thanks to PCRs using a set of chromosomal and plasmid primers specific to E. amylovora in order to study the variability of the isolated strains in comparison with previously described strains isolated in other countries. In parallel, I tested the degree of pathogenicity of these isolates by performing tests of pathogenicity, mobility and biofilm production capacity.The second part of my thesis deals with the impact of nitrogen (N) on the E. amylovora - A. thaliana interaction. Recently, my team has shown that low nitrate supply reduces the resistance of A. thaliana to E. amylovora and promotes the expression of hrp virulence genes in planta. Since the apoplast is the site of primary infection and exchange of molecules between the plant and the bacteria, some of which may be repressors or inducers of bacterial virulence genes. Based on this information, I showed in vitro that the apoplastic fluid (AWF) of A. thaliana grown under N limitation (AWF2) strongly induces hrp genes compared to that of plants grown under high N (AWF10). Metabolomic analyses of AWF allowed me to identify 114 primary metabolites, 102 of which are more accumulated in AWF10 and only 12 are more accumulated in AWF2. Among these metabolites I identified several metabolites that induce hrp gene expression, such as linolenic acid and cyanuric acid, and several hrp repressors such as citrate and GABA. Furthermore, I found that AWF2 content is more sensitive to infection by E. amylovora than AWF10. In conclusion, I have shown that N supply to plants affects the apoplastic content and thus affects the ability of E. amylovora to induce its virulence factors during the early stages of infection.

French. Erwinia amylovora est une bactérie responsable de la maladie du feu bactérien dont les hôtes appartiennent à la sous famille des rosacées, comme le pommier, le poirier et le cognassier. En 2012, E. amylovora a été identifiée en Tunisie, notamment dans le nord où les conditions climatiques sont favorables pour le développement rapide de cette pathologie. La première partie de ma thèse a consisté à isoler et identifier des souches d’E. amylovora à partir du Nord de la Tunisie. La sélection de vingt isolats a été réalisée en se basant sur l’aspect morphologique des colonies, par des méthodes biochimiques et moléculaires grâce à des PCRs en utilisant un ensemble d’amorces chromosomiques et plasmidiques spécifiques d’E. amylovora afin d’étudier la variabilité des souches isolées par rapport aux souches précédemment décrites isolées dans d’autres pays. En parallèle, j’ai testé le degré de pathogénicité de ces isolats en faisant des tests de pouvoir pathogène, de mobilité et de capacité de production de biofilms. La deuxième partie de ma thèse porte sur l’impact de l’azote (N) sur l’interaction E. amylovora - A. thaliana. Mon équipe a montré qu’un faible apport en nitrate réduit la résistance d’A. thaliana à E. amylovora et favorise l’expression in planta des gènes de virulence hrp. L’apoplasme, un des lieux d’infection primaire d’E. amylovora, permet l’échange de métabolites entre la plante et la bactérie, dont certains peuvent être des répresseurs ou des inducteurs des gènes de virulence bactériens. J’ai montré, in vitro, que le liquide apoplastique (AWF) extrait de feuilles d’A. thaliana cultivées en limitation de N (AWF2) induit plus fortement les gènes hrp d’E. amylovora que l’AWF de plantes cultivées à fort N (AWF10). L’analyse métabolomique par GC-MS de l’AWF2 et de l’AWF10 m’a permis d’identifier 114 métabolites primaires dont 102 sont plus accumulés dans l’AWF10 et seulement 12 sont plus accumulés dans l’AWF2. Parmi ces métabolites j’ai identifié des métabolites inducteurs des gènes hrp, comme l’acide linolénique et l’acide cyanurique et des répresseurs comme le citrate et le GABA. Suite à l’infection, 92 métabolites ont été identifiés dans l’AWF. Cependant, le contenu de l’AWF2 est plus sensible à l’infection que l’AWF10 après 6H d’infection. En conclusion, j’'ai montré qu’en condition de limitation en azote, le contenu métabolique de l’apoplasme de la feuille est modifié et de ce fait affecte la capacité d’E. amylovora à induire ses facteurs de virulence au cours des premières étapes de l’infection.