Toward the development of a new approach to decipher the molecular mechanisms involved in root aerenchyma formation in rice | Vers le développement d'une nouvelle approche pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans la formation des aérenchymes racinaires chez le riz

English. Aerenchyma are cavities that develop from the cortex cells of many cultivated plants andplay a key role in submergence tolerance. They ensure the diffusion of oxygen from the shoot to theroot and are part of the adaptation mechanisms to flooding in rice. Aerenchyma also has a favorablerole in many limiting crop conditions, such as nutritional deficiencies or water stress. The genes andmolecular mechanisms involved in its formation are mostly unknown. However, their knowledge is anessential step in better understanding their formation but also in developing varieties that are moretolerant to flooding or many environmental stresses.The formation of aerenchyma takes place in the cortex, a ground tissue, and is divided intofour developmental phases. A microdissection (LM) laser protocol has been developed that hasallowed us to construct tissue-specific RNA extraction for all stages of aerenchyma formation fromextremely small amounts of biological material. The LM technology was coupled to the digital dropletPCR and allowed us to analyze the tissue-specific expression of root genes, also from extremely smallamounts of RNA. We then worked with Nugen to develop a protocol for the construction of RNAseqbanks from low quantities of RNA. This protocol was used to build RNAseq banks covering all stagesof formation and differentiation of aerenchyma and adjacent tissues. Analyses are ongoing and theregulatory networks will be rebuilt thanks to the collaboration with the I3Bionet team. The function ofthe most influential transcription factors will then be analyzed, first in protoplasts, then in planta.In order to validate quickly and at high throughput in protoplasts, the genes potentiallyinvolved in the formation and differentiation of aerenchyma we have developed a technologyderived from CRISPR/Cas9 allowing the construction of synthetic transcript factors (FTS). We wereable to activate or repress a reporter gene and report the efficiency of the different designed FTs. Thenext step will be to demonstrate that we can simultaneously activate and suppress gene expressionfor rice genes and use this tool to validate at high throughput the genes potentially involved in theformation of aerenchyma.Beyond their application to elucidating the molecular mechanisms of root aerenchymaformation, the tools developed in this work are sufficiently generic to be used for other species or forthe study of other biological mechanisms at the molecular level.

French. Les aérenchymes sont des cavités qui se développent à partir des cellules du cortex de nombreuses plantes cultivées et jouent un rôle clef dans la tolérance à la submersion. Elles assurent la diffusion d’oxygène des parties aériennes vers les parties racinaires et font partie des mécanismes d’adaptation à la submersion chez le riz. Les aérenchymes ont également un rôle favorable dans den ombreuses conditions de cultures limitantes, comme les carences nutritionnelles ou les stress hydriques. Les gènes et mécanismes moléculaires qui interviennent dans sa formation sont pour la plupart inconnus. Leur connaissance est pourtant une étape indispensable pour mieux comprendre leur formation mais également pour permettre le développement de variétés plus tolérantes à la submersion ou à de nombreux stress environnementaux.La formation des aérenchymes se déroule dans le cortex, un tissu racinaire interne et se décompose en quatre phases. Un protocole de laser microdissection (LM) a été développé qui nous a permis de construire d’extraire de l’ARN tissus-spécifique pour toutes les étapes de formation des aérenchymes à partir de quantités extrêmement faibles de matériel biologique. La technologie LM a été couplée à la droplet digital PCR et nous a permis d’analyser l’expression tissu-spécifique de gènes racinaires, à partir la aussi de quantités extrêmement faibles d’ARN. Nous avons alors construit avec la société Nugen un protocole pour la construction de banques RNAseq à partir de ces petites quantité d’ARN. Ce protocole a été utilisé pour construire des banques RNAseq couvrant toutes les étapes de formation et de différenciation des aérenchymes et des tissus adjacents. Les analyses sont en cours et les réseaux de régulation seront reconstruits grâce à une future collaboration avec l’équipe I3Bionet.Les fonctions des facteurs de transcription les plus influents seront alors analysées, dans un premier temps en protoplastes, puis in planta.Afin de valider rapidement et à haut débit en protoplastes, les gènes potentiellement impliqués dans la formation et la différenciation des aérenchymes nous avons développé une technologie dérivée de CRISPR/Cas9 permettant la construction de facteurs de transcriptions synthétiques (FTS), les systèmes CRIPR activation (CRISPRa) et inhibition (CRISPRi). Nous avons pu démontrer qu’en système protoplaste nous étions capable d’activer ou de réprimer un gène rapporteur efficacement. La prochaine étape sera de démontrer que nous pouvons simultanément activer et réprimer l’expression de gènes chez le riz et utiliser cet outil pour valider à haut débit les gènes potentiellement impliqués dans la formation des aérenchymes.Au-delà de leur application pour l’élucidation des mécanismes moléculaires de formation des aérenchymes racinaires, les outils développés au cours de ce travail sont suffisamment génériques pour être utilisés pour d’autres espèces ou pour l’étude d’autres mécanismes biologiques à l’échelle moléculaire.