Experimental evolution of Escherichia coli towards hyperpersistence and resistance to ciprofloxacin | Evolution expérimentale d'Escherichia coli vers l'hyperpersistance et la résistance à la ciprofloxacine

English. Excessive or inappropriate use of antibiotics has contributed to the development of strategies in many bacteria that allow them to survive antibiotic treatments. Recent studies showed that tolerance and persistence levels (ability to survive transiently, without growth, in the presence of antibiotics) can increase rapidly in bacteria exposed to repeated antibiotic treatments and promote their evolution towards "classical" resistance (ability to grow in the presence of antibiotics). The first objective of this thesis was to select and characterize tolerance and/or persistence mutations by repeatedly exposing a susceptible Escherichia coli strain to constant clinical concentrations (static conditions) of ciprofloxacin. We observed the emergence of gyrB mutants with a hyperpersistant phenotype specific to fluoroquinolones, without a significant increase in the MIC of ciprofloxacin. The L422P mutation identified by Whole Genome Sequencing is located outside the canonical QRDR of GyrB but in the conserved TOPRIM catalytic domain of DNA gyrase, the main target enzyme of quinolones. The second objective was to test the hypothesis that the evolution towards resistance is favored in a hyperpersistent strain. We followed the evolution of resistance in three isogenic strains of Escherichia coli, susceptible, hyperpersistant (GyrB L422P mutant) and resistant (GyrB S464Y mutant) repeatedly exposed to fluctuating concentrations of ciprofloxacin ("dynamic" conditions) mimicking those of a patient under treatment. At the end of the 10-day treatment in bioreactor, we observed increased resistance with same level (MIC of ciprofloxacin 0.125 µg/mL) in the mutants from the three parental strains. The susceptible strain showed the most important and rapid increase in resistance. The hyperpersistant strain therefore did not appear favored in terms of resistance acquisition. Furthermore, the evolution of this hyperpersistent strain was not accompanied by additional mutations in the quinolone target genes, unlike that of the susceptible and resistant strains, some of whose derived clones carried quinolone resistance mutations at codons 83 and 87 of gyrA. Our results indicate that mutations that may occur in neglected regions (outside the QRDR) of the target genes of (fluoro)quinolones may alter the bactericidal effect of these antibiotics without significantly increasing the level of resistance, but rather by conferring a hyperpersistent phenotype. It seems important that, in addition to the resistance of infectious bacterial strains (routinely assessed by antibiograms or MIC measurements), tolerance/persistence phenotypes are better considered in the choice of antibiotic therapies.

French. L'utilisation excessive ou inadaptée des antibiotiques a contribué au développement chez de nombreuses bactéries de stratégies leur permettant de survivre aux traitements antibiotiques. Des études récentes ont montré que les niveaux de tolérance et de persistance (capacité de survivre transitoirement, sans croissance, en présence d'antibiotique) peuvent augmenter rapidement chez des bactéries exposées à des traitements antibiotiques répétés et favoriser l'évolution de celles-ci vers la résistance "classique" (capacité à croître en présence d'antibiotiques). Le premier objectif de cette thèse était de sélectionner et de caractériser des mutations de tolérance et/ou de persistance en exposant une souche sensible d'Escherichia coli de façon répétée à des concentrations cliniques constantes (conditions "statique") de ciprofloxacine. Nous avons observé l'émergence de mutants gyrB présentant un phénotype d'hyperpersistance spécifique aux fluoroquinolones, sans augmentation significative de la CMI de ciprofloxacine. La mutation L422P identifiée par séquençage du génome entier se trouve en dehors de la QRDR canonique de GyrB mais dans le domaine catalytique conservé TOPRIM de l'ADN gyrase, l'enzyme cible principale des quinolones. Le second objectif était de tester l'hypothèse selon laquelle l'évolution vers la résistance est favorisée chez une souche hyperpersistante. Nous avons suivi l'évolution de la résistance trois souches isogéniques d'Escherichia coli, sensible, hyperpersistante (mutant GyrB L422P) et résistante (mutant GyrB S464Y) exposées de façon répétée à des concentrations fluctuantes de ciprofloxacine (conditions "dynamiques") mimant celles d'un patient sous traitement. Au terme des 10 jours de traitement en bioréacteur, nous avons observé une résistance augmentée jusqu'à un niveau identique (CMI de ciprofloxacine de 0,125 µg/mL) chez les clones issus des trois souches parentales. La souche sensible est celle dont l'augmentation de la résistance était la plus forte et la plus rapide. La souche hyperpersistante n'est donc pas apparue favorisée en termes d'acquisition de résistance. De plus, l'évolution de cette souche hyperpersistante ne s'est pas accompagnée de mutations additionnelles dans les gènes cibles des quinolones, contrairement à celle des souches sensible et résistante, dont certains clones dérivés portaient des mutations de résistance aux quinolones aux codons 83 et 87 de gyrA. Nos résultats indiquent que certaines mutations pouvant survenir dans les régions négligées (hors QRDR) des gènes cibles des (fluoro)quinolones peuvent altérer l'effet bactéricide de ces antibiotiques sans augmenter significativement le niveau de résistance, mais en conférant plutôt un phénotype d'hyperpersistance. Il semble important, qu'en plus de la résistance des souches bactériennes infectieuses (évoluée en routine par des antibiogrammes ou mesures de CMI), les phénotypes de tolérance/persistance soient mieux pris en considération dans le choix des thérapies antibiotiques.