A few observations about the role of copper ATPases HMA1 and PAA1 in the control of chloroplastic copper's homeostasis | Quelques observations sur le rôle des ATPases à cuivre HMA1 et PAA1 dans le contrôle de l'homéostasie du cuivre chloroplastique

English. The chloroplast is an organelle specific of the plant cell. It is surrounded by a double membrane or envelope which carries numerous transport systems for ions and metabolites, essential for the function of the chloroplast and the plant cell. At this point, only a few transporters associated with chloroplastic envelope had been identified: An iron transporter, a magnesium transporter and two copper P1B ATPases: HMA1 and PAA1. PAA1 is known to be the main pathway of copper import in the chloroplast, metal mainly used for photosynthesis. HMA1 is thought to be an additional pathway for copper import, essential to cope with an oxidative stress witch appears when the plant is grown under high light condition. In order to better understand the respective roles of these two ATPases in chloroplastic copper's homeostasis, two complementary approaches had been developed: - An in planta approach had been initiated to obtain some new lines affected in the expression of one (paa1 mutant overexpressing HMA1) or both ATPases (hma1/paa1 double knock out), then to identify conditions (light stress, saline stress, metal excess) revealing the essential role of these ATPases or inducing a different transcriptional response for genes encoding for theses ATPases or other actors of copper's homeostasis... Results obtained show that the function of HMA1, known to be essential during a light stress, is also required when plants have to cope with a salt stress. These results are new evidences that HMA1 has a role in copper's delivery to the chloroplastic copper/zinc superoxyde dismutase. Moreover, we have shown that in photoautotrophic culture condition, copper can partially restore the photosensibility of a hma1 mutant thus validating that HMA1 in linked with copper homeostasis. We also have demonstrated that HMA1 and PAA1 function are not redundant. The copper imported by these two ATPases is very likely delivered to target proteins by distinct pathways. At last, we have shown that a third copper import pathway in the chloroplast exists, pathway still not characterized. - An in vitro approach meant to produce HMA1 and PAA1 ATPases in the Lactococcus lactis heterologous expression system had been developed to determine their ionic specificities and biochemical characteristics. The prokaryotic expression system had been developed in the laboratory is perfectly suited for membrane protein production including HMA1 and PAA1. Yields obtained are appropriate for further biochemical analyses. We have determined the conditions of solubilisation and purification of these two proteins. So far, we had not been able to measure ATPase activity associated with these proteins but our data indicates that both of the proteins can bind one of their substrate: ATP. We also demonstrated that PAA1 can bind copper under its 1+ and 2+ form. Finally, these data suggests that the control of chloroplastic copper homeostasis requires several independent transport systems and a tight regulation of these copper import pathways in order to fill up the needs linked to photosynthesis and resistance mechanism to oxidative stress.

French. Le chloroplaste est un organite spécifique de la cellule végétale. Il est délimité par une double membrane ou enveloppe qui renferme de nombreux systèmes de transports d'ions et de métabolites essentiels au fonctionnement du chloroplaste et de la cellule végétale. A ce jour, seuls quelques transporteurs de métaux associés à l'enveloppe des plastes ont été identifiés : un transporteur de fer, un transporteur de magnésium ainsi que deux ATPases à cuivre de type P1B : HMA1 et PAA1. PAA1 représenterait la voie principale d'import du cuivre dans le chloroplaste, notamment pour alimenter la photosynthèse. HMA1 constituerait une voie additionnelle d'import du cuivre, voie essentielle pour répondre à un stress oxydatif qui apparaît en particulier lorsque la plante est cultivée en lumière forte. Afin de mieux comprendre les rôles respectifs de ces deux ATPases dans la régulation de l'homéostasie du cuivre chloroplastique, deux approches complémentaires ont été développées : - une approche in planta visant à produire de nouvelles lignées affectées dans l'expression de l'une (mutant paa1 surexprimant HMA1) ou de ces deux ATPases (double mutant hma1/paa1), puis à identifier des conditions (stress lumineux, stress salin, excès de métaux) révélant le rôle essentiel de ces ATPases ou induisant une réponse transcriptionnelle différente des gènes codant ces ATPases ou d'autres acteurs liés à l'homéostasie du cuivre... Les résultats obtenus montrent que la fonction de HMA1, connue pour être essentielle lors d'un stress lumineux, est aussi requise lorsque la plante subit un stress salin. Ces résultats confortent le rôle de HMA1 dans la délivrance du cuivre à la superoxyde dismutase (cuivre/zinc) du chloroplaste. D'autre part, nous avons montré qu'en condition de culture photoautotrophe, le cuivre permet de supprimer partiellement la photosensibilité du mutant hma1, validant ainsi l'implication de HMA1 dans l'homéostasie du cuivre. Nous avons aussi démontré que les fonctions de HMA1 et PAA1 ne sont pas redondantes. Le cuivre importé par ces deux ATPases est probablement délivré à des protéines cibles par des voies différentes. Enfin, nous avons montré qu'il existe une troisième voie d'import de cuivre dans le chloroplaste, voie encore non caractérisée. - une approche in vitro visant à produire ces deux ATPases HMA1 et PAA1 dans le système hétérologue Lactococcus lactis afin de déterminer leurs spécificités ioniques et leurs caractéristiques biochimiques. Le système d'expression procaryote L. lactis a été mis en place au laboratoire et s'avère parfaitement adapté à la production de protéines membranaires de plantes. Ce système a permis de produire plusieurs protéines membranaires d'Arabidopsis, dont HMA1 et PAA1, en quantités compatibles avec des analyses biochimiques. Nous avons déterminé les conditions de solubilisation et de purification de ces deux protéines. Nous n'avons pas pu mesurer d'activité ATPase associée à ces protéines. En revanche, nos données indiquent que ces deux protéines recombinantes peuvent lier l'un de leur substrat ; l'ATP. Nous avons aussi pu démontrer que PAA1 peut lier du cuivre sous forme 1+ et sous forme 2+. Au bilan, ces données suggèrent que le contrôle de l'homéostasie du cuivre chloroplastique requiert plusieurs systèmes de transport indépendants et une régulation fine de ces voies d'import de cuivre afin d'alimenter les besoins liés à la photosynthèse et les besoins liés aux mécanismes de résistance aux stress oxydatifs.