Die Bindung von Ca2+-Ionen an Zebrafisch-GCAP4

Die Guanlylate Cyclase-activating Proteins (GCAPs) stellen eine Subfamilie der Neuronal Calcium Sensor (NCS)-Proteine dar. Diese wiederum gehören zur Superfamilie der EF-Hand-Calcium-Bindungsproteine. Von den vier EF-Händen ist bei NCS-Proteinen die erste nicht funktionell. Zudem sind die NCS-Proteine überwiegend N-Terminal myristoyliert. Beides gilt auch für GCAPs. Bisher wurden neun Mitglieder der GCAP-Familie entdeckt. Neben den länger bekannten GCAP1-3 wurden kürzlich im Zebrafisch die zapfenspezifischen GCAP4, 5 und 7 (zGCAPs) entdeckt. Wohingegen gerade GCAP1-2 gut charakterisiert sind, ist über die zGCAPs wenig bekannt. Über GCAP1-2 ist bekannt, dass sie calciumabhängige Konformationsänderungen eingehen und ihr Zielenzym, die Gyanylate Cyclase (GC), calciumabhängig regulieren. Bei hohen intrazellulären Calciumkonzentrationen inhibieren sie die GC, bei niedrigen aktivieren die GCAPs sie. Damit spielen sie eine wichtige Rolle in der Phototransduktion und Lichtadaptation. Auch bei zGCAP4 konnten mittlerweile calcium-abhängige Konformationsänderungen und eine calciumabhängige Regulation der GC gezeigt werden. In dieser Arbeit konnte zGCAP4 zunächst durch die heterologe Expression in E. coli und Reinigung als Wildtyp, als A6S-Mutante (zur hinreichenden Myristoylierung) und als myristoylierte Mutante (was per Reversed Phase-Chromatographie sichergestellt wurde) in ausreichenden Mengen für Experimente gewonnen werden. Mit dem gereinigten zGCAP4 konnten dann verschiedene Experimente zur Bindung von Ca2+-Ionen an dieses durchgeführt werden. Zum einen wurde die elektrophoretische Mobilität von zGCAP4 untersucht, die wie bisher auch unter Ca2+-Einfluss höher, unter Mg2+-Einfluss aber wesentlich niedriger war. Zum anderen wurde ein Ca2+-Bindungs-Assay mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2 als Ca2+-Indikator etabliert, der für alle zGCAP4-Varianten (und auch für myrbGCAP2) die Bindung von 3 Ca2+-Ionen ergab. Allerdings scheint es, dass tatsächlich nur 2 Ca2+-Ionen titriert wurden und dass dritte lediglich auf die Insensitivtät des Fura-2 zurückzuführen war. Daneben wurden mit dem zGCAP4 auch isotherme Titrationscalorimetrien (ITCs) durchgeführt. Die dabei erhaltenen Titrationskurven konnten mit einem Kurvenanpassungsmodell für 2 voneinander unabhängige Bindestellen von Ca2+-Ionen an zGCAP4 am besten beschrieben werden, ebenfalls ein Hinweis auf nur 2 titrierte Ca2+-Ionen. Bei beiden Experimenten ist dies aber wohl auf eine unzureichende Decalcifizierung des zGCAP4 zurückzuführen. Außerdem hat sich gezeigt, dass die Ergebnisse des Ca2+-Bindungs-Assays und der ITCs miteinander korrelieren. Beide liefern für die eine Bindestelle KD-Werte im niedrigen zweistelligen nanomolaren Bereich und für die andere im höheren dreistelligen nanomolaren Bereich.