Obtención de anticuerpos anti-fosfolipasa A2 del veneno de Bothrops diporus en conejos y neutralización de la actividad fosfolipasa in vitro

La investigación en la producción de antivenenos, tradicionalmente obtenidos en mamíferos tras vacunaciones con veneno entero, busca nuevas formulaciones tendientes a reducir la carga proteica de los sueros con el objeto de disminuir la aparición de reacciones adversas en el paciente intoxicado. Es factible inducir la producción de anticuerpos neutralizantes de toxinas de los venenos a partir de inoculaciones en conejos con una toxina dada y obtener anticuerpos IgG monovalentes contra la proteína aislada. El objetivo del trabajo es la obtención de los anticuerpos IgG anti-fosfolipasa a partir del suero de conejo, inoculado con fosfolipasa A2 (PLA2) aislada del veneno de Bothrops diporus (yarará chica) para luego constatar su capacidad de neutralización de la actividad fosfolipasa in vitro del veneno entero. Las inmunoglobulinas (del tipo IgG) generadas en el animal mediante un plan de inmunización con PLA2 botrópica, fueron aisladas del suero hiperinmune de conejos mediante cromatografía de afinidad, con empleo de columna Hitrap Protein G HP instalada en un sistema ÁKTA prime plus (GE), eluyéndolas con buffer de glicina- HCI 0.1 M; pH: 2.5 y su homogeneidad se controló por SDS-PAGE. La presencia de IgG anti-PLA2 en el pool concentrado se testeó por el Método de Outcherlony enfrentando a la enzima y a veneno entero correspondiente. Se ensayó la capacidad neutralizante de las antitoxinas obtenidas mediante hemolisis indirecta (descripto por Gutiérrez y colaboradores), determinándose la dosis de anticuerpos (ug) que neutraliza en un 100% la formación de un halo de hemolisis que la toxina, presente en 1 ug de veneno, genera en una placa de agarosa con glóbulos rojos y una fuente de fosfatidil colina como sustrato de la enzima (Dosis Efectiva 100, DE100) luego de su incubación durante 20 h a 37° C. Para ello se preincubaron durante 30 minutos distintas mezclas de antígeno/anticuerpo, enfrentando el pool de IgG anti-PLA2.purificadas (10,76 mg/ml) con diferentes diluciones de veneno de B. diporus en PBS (1 a 0,015 mg/ml) en partes iguales, las cuales se sembraron en placas de agar sangre-yema de huevo, para posterior lectura del halo hemólitico al término de su incubación en estufa termostatizada a 37°C. La inmunización de conejos con la toxina (PLA2) produjo un suero rico en IgGs que, luego de la separación cromatográfica, mostró una banda única de 150 kDa en condiciones no reductoras, y dos bandas homogéneas de 50 y 25 kDa en presencia de b-mercaptoetanol, mediante SDS-PAGE. La capacidad de reconocer específicamente a la toxina (PLA2) se comprobó en placa de agar, formándose una única banda de inmunoprecipitación tanto frente al veneno entero como a la enzima. Las IgG antiPLA2 así obtenidas fueron capaces de neutralizar por completo la actividad hemolítica indirecta inducida por el veneno entero mediante ensayo in vitro, obteniéndose un valor para la DE100 del pool de antitoxinas de 347 ug de IgG/ug de veneno de Bothrops diporus. Estos resultados arrojan evidencia preliminar sobre la factibilidad de elaborar nuevas formulaciones de inmunoterápicos a partir de estos anticuerpos específicos, dirigidos contra una de las toxinas más deletéreas del veneno. Se requiere entonces extender los estudios hacia ensayos in vivo evaluando la actividad neutralizante de la letalidad, la miotoxicidad otras actividades biológicas que exhibe el veneno entero botrópico.