Producción, purificación y caracterización de tres hexosaminidasas lisosomales recombinantes en pichia pastoris

La deficiencia o alteración de una proteina homopolimérica o heteropolimérica en el organismo puede causar una de cientos de enfermedades monogénicas conocidas. Las N-acetilhexosaminidasas, lisosomales, son un grupo de enzimas poliméricas formadas por subunidades codificadas por genes diferentes HEXA y HEXB formando tres isoenzimas diferentes: un heteropolímero HexA (ap), y dos homopolímeros HexB y HexS (pp y aa respectivamente). Tay Sachs y Sandhoff, o gangliosidosis GM2, son producidas por la alteración en la actividad de Hex-A o Hex-B respectivamente. Hasta el momento estos trastornos lisosomales no tienen una terapia aprobada, sin embargo, la terapia de reemplazo enzimàtico (TRE) se ha venido estudiando como una posible alternativa viable para este tipo de enfermedades. A la fecha las enzimas aprobadas para TRE han sido enzimas coexpresadas a partir de un solo gen, y han sido obtenidas generalmente en células de mamífero. Sistemas de expresión como los microorganismos han sido evaluados debido a su facilidad de cultivo, su mayor rendimiento de producción y su costo relativamente menor al que genera la producción de enzimas recombinantes en células de mamífero con fines terapéuticos. Las levaduras tienen la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales semejantes a las humanas, una ventaja que se debe tener en cuenta para cumplir con los requerimientos mínimos necesarios de pureza y funcionalidad biológica de una enzima nativa. En este estudio las enzimas Hex-A, Hex-B y Hex-S fueron producidas en la levadura metilotrófica Pictiia pastoris, empleando genes optimizados para su expresión. El péptido señal nativo fue retirado, y se mantuvo la señal de secreción (a-Factor) de Saccharomyces cerevísiae. Los genes se subclonaron en el plásmido pPIC9K independientemente. La producción de las enzimas recombinantes se evaluó en muestras extracelulares. En cultivos a 1,65 L las actividades específicas más altas fueron 12.624 U mg'1 para rhHex-A, 10.343 ü mg'1 para rhHex-B y 14.606 U mg'1 para rhHex-S. Estas enzimas recombinantes mostraron estabilidad al ser incubadas a 4 y 37°C durante 48 horas, a pH entre 4,0 y 5,0 y a incubación en suero humano. Todas las proteínas recombinantes fueron internalizadas por líneas celulares HEK293 y fibroblastos normales en cultivo, posiblemente mediada por diferentes vías endocíticas y por receptores de manosa y manosa-6-fosfato. Fue posible visualizar el tráfico intracelular mediante microscopía confocal. Estos resultados mostraron el potencial tanto de P. pastoris GS115 para la producción de proteínas diméricas recombinantes como de las hexosaminidasas lisosomales recombinantes obtenidas en este trabajo como posibles herramientas terapéuticas para ser usadas en TRE.

Deficiency or alteration of homopolymeric or heteropolymeric proteins in the body can cause one of hundreds of monogenic diseases known. The lysosomal,N-acetylhexosaminidases.are a group of proteins encoded by two different genes HEXA and HEXB forming three different polymeric isoenzymes, one heteropolymer HexA (ap), and two homopolymers Hex-B and Hex-S (aa and pp respectively). Tay Sachs and Sandhoff, or GM2 gangliosidoses, are caused by alteration in the activity of Hex-A or B respectively. At this moment these lysosomal disorders have not approved therapy, however, enzyme replacement therapy (ERT) could be an available alternative that has been studied for these diseases. To date enzymes approved for TRE have been co-expressed from a single gene, and have generally been obtained in mammalian cells. Other expression systems such as microorganisms have been evaluated because are easy to manipulate and growth, have higher production yields, and are relatively cheaper than mammalian cells production of therapeutic proteins. Yeasts have the ability to perform postranslational human-like modifications, which are an advantageous to meet the minimum requirements of purity and biological function of the native enzyme. In this study, Hex-A, Hex -B and Hex-S enzymes were produced in the methylotrophic yeast Pichia pastoris using optimized expression genes. The native signal peptide was removed, and had secretion signal (a-factor) of Saccharomyces cerevisiae. The genes were sub-cloned into plasmid pPIC9K independently. The production of recombinant enzymes was evaluated in extracellular samples. The highest specific activities obtained from cultures at 1.65 L were 12,624 U mg'1 rtiHex-A, 10,343 U mg'1 rhHex-B and 14,606 U mg'1 rhHex-S. These recombinant enzymes showed stability at 4 and 37°C during 48 h of incubation, at pH between 4,0 and 5,0 and incubation in human serum. All recombinant proteins were internalized by cultured cells, HEK293 and normal fibroblasts, possibly mediated by endocytic pathways and different mannose and mannose 6-phosphate receptors. It was possible to visualize intracellular trafficking by confocal microscopy. These results show the potential of P. pastoris GS115 for producing recombinant dimeric proteins and the potential of recombinanr hexosaminidases as therapeutic tools for use in ERT.

Doctor en Ciencias Biológicas

Doctorado