Optimization of the protocol for assembly of recombinant adeno-associated viruses of serotype 2 for delivery of african swine fever virus genes into mammalian cells | Оптимизация протокола сборки рекомбинантных аденоассоциированных вирусов 2 серотипа для доставки генов вируса африканской чумы свиней в клетки млекопитающих

English. African swine fever (ASF) is a highly contagious viral disease of the Suidae family representatives, the mortality rate in primary foci of which reaches 100%. To date, the means of specific prevention of ASF have not been developed. There are various methods for creating candidate vaccines against ASF, but the development of alternative antigenic variants with low reactogenicity and high immunogenicity is still relevant. It is known that the production of recombinant adeno-associated virus, a potential tool for delivering ASF virus target genes into mammalian cells, is influenced by many factors, in particular, the cell line, expression system, cell culture conditions after transfection, and the quality of the initial plasmid DNA. The assembly protocol for recombinant AAV2 carrying the major capsid protein gene of the ASFV B646L as a model cargo was optimized. During the research, it was established that the protocol used allowed achieving a genuine virus titer of (2.45 ± 0.17) x 10E7 viral particles per mcl, while the share of fully assembled viral capsids accounts for up to (79.3 ± 2.3)% of all genomic copies. When assessing the potential cytopathogenic effect of recombinant AAV2 on target cells (SPEV, porcine MSCs), it was found that high MOI (up to 10,000 viral particles per cell) did not lead to an increase in the proportion of apoptotic cells. The functionality of the developed AAV2-based construct was confirmed: in the lysates of transduced cells, the mature p72 protein with a molecular weight of 73 kDa was detected, specifically reacting in the Western blotting technique with hyperimmune pig serum. The data confirm the potential of AAV2 as a tool for delivering ASF virus genes into porcine cells, which makes it a promising basis for the design of candidate vaccines.

Russian. Африканская чума свиней (АЧС) – высококонтагиозная вирусная болезнь представителей семейства Suidae, смертность в первичных очагах которой достигает 100%. До сегодняшнего дня средства специфической профилактики АЧС не разработаны. Существуют различные методы создания кандидатных вакцин против АЧС, но разработка альтернативных антигенных вариантов, обладающих низкой реактогенностью и высокой иммуногенностью, по-прежнему актуальна. Известно, что на продукцию рекомбинантных аденоассоциированных вирусов – потенциальных средств доставки целевых генов вируса АЧС в клетки млекопитающих – влияет множество факторов, в частности, клеточная линия, система экспрессии, условия культивирования клеток после трансфекции и качество исходных плазмидных ДНК. Оптимизирован протокол сборки рекомбинантных AAV2, несущих ген мажорного капсидного белка B646L вируса АЧС в качестве модельного карго. В ходе исследований установлено, что применяемый протокол позволяет достичь истинного титра вируса (2,45±0,17) x 10E7 вирусных частиц на мкл, при этом на долю полноценно собранных вирусных капсидов приходится до (79,3±2,3)% всех геномных копий. При оценке потенциального цитопатогенного действия рекомбинантных ААV2 на целевые клетки (SPEV, МСК свиней) было выявлено, что высокие MOI (до 10000 вирусных частиц на клетку) не приводят к увеличению доли апоптотических клеток. Подтверждена функциональность разработанной конструкции на основе ААV2: в лизатах трансдуцированных клеток обнаруживался зрелый белок p72 с молекулярной массой 73 кДа, специфически реагирующий при вестерн-блоттинге с гипериммунной сывороткой свиньи. Полученные данные в совокупности подтверждают потенциал ААV2 как инструмента доставки генов вируса АЧС в клетки свиней, что делает его многообещающей основой для конструирования кандидатных вакцин.