Estudo estrutural e de conservação de sequências e produção de fitase por Pichia pastoris visando sua aplicação para o aumento da digestibilidade de rações para monogástricos | Structural and sequence conservation analysis and production of a phytase by Pichia pastoris aiming its application for improving the digestibility of feed for monogastrics

A utilização eficiente dos nutrientes pelos animais é fator de grande relevância para indústria de nutrição animal. Esse resultado depende da eficiência da fitase sobre o complexo fitato-minerais, o qual representa, nos alimentos, um fator antinutricional pelo aprisionamento de nutrientes essenciais requeridos para o bom desempenho dos animais. No entanto, a pouca resistência a altas temperaturas e ao ambiente gástrico dos animais podem comprometer a aplicação dessa enzima, reduzindo assim a eficiência de utilização de nutrientes, com consequente problemas econômicos e ambientais. Para tal efeito, torna-se necessário a obtenção de uma fitase que seja capaz de hidrolisar o fitato nestas condições. Assim, entender o mecanismo de ação das fitases permitiria a obtenção de fitases com características adequadas requeridas para sua aplicação. Este trabalho teve como objetivos análise estrutural e estudos de conservação de fitases para otimização de uma fitase para aplicação industrial. Dessa forma, a primeira parte deste trabalho compreende a formação de um banco de dados de fitases e análises comparativas estruturais em relação às propriedades bioquímicas destas enzimas, a fim de compreender fatores que influenciam na estabilidade dessas enzimas. Outra etapa da pesquisa, consistiu no estudo de expressão e caracterização da fitase de Dendroctonus frontalis, selecionada entre as fitases estudadas por apresentar estabilidade térmica satisfatória. Foram também avaliados estudos de secagem dos extratos de fitase obtidos a partir desta, pelos métodos de liofilização e Spray Dryer. Com base nas propriedades bioquímicas e no alinhamento de sequências de aminoácidos, observamos alta variabilidade entre as fitases estudadas, com propriedades bioquímicas bastante distintas, apesar destas apresentarem semelhança estrutural. No entanto, na análise estrutural comparativa, o número de interações de Van der Waals, interações iônicas, hidrogênio e ligações dissulfeto que constituem essas fitases não explicaram asdiferenças nas suas propriedades bioquímicas. A sequência codificadora da fitase selecionada foi sintetizada no plasmídeo pPICZαB e expressa em Pichia pastoris. Após a clonagem e seleção dos transformantes, a expressão da fitase foi avaliada em diferentes composições de meios de cultivo e pHs. O uso dos meios mBMMH e BMMY em pH 5,0 promoveram um aumento de 3 vezes no nível de expressão da fitase em relação à expressão realizada em BMMH. A enzima expressa possuiu maior atividade em pH 4,0 e temperatura de 42 °C. Entretanto, sua estabilidade foi drasticamente reduzida quando submetida a temperaturas de 70 e 80 °C, por apenas 1 min. A secagem dos extratos por liofilização preservou 62 % da atividade enzimática, na presença de maltodextrina a 5 %. Na ausência desse composto, apenas 41 % de atividade foi recuperada. Os extratos submetidos a secagem por Spray Dryer, apresentaram maior atividade residual a 100 °C e 5 % de maltodextrina, acima desta condição a atividade reduziu significativamente. Embora a secagem dos extratos por Spray Dryer tenha causado redução significativa na atividade enzimática, o seu uso permitiu que o pó seja armazenado por pelo menos 240 dias à temperatura ambiente, sem perda de atividade. A partir deste estudo podemos concluir que o mecanismo de ação de uma fitase está intimamente relacionada a sua estrutura e sua eficiência precisa ser analisada individualmente de acordo ao sistema de expressão escolhido. Este trabalho pode auxiliar para uma melhor compreensão do mecanismo de ação das fitases e obtenção de novas fitases para aplicação comercial. Palavras-chave: Ácido fítico. Fitase. Conservação de sequências enzimáticas. Aplicação industrial. Estabilidade enzimática.

The efficient use of nutrients by animals is a factor of great relevance for the animal nutrition industry. This result depends on the efficiency of phytase on the phytate-mineral complex, which represents an anti-nutritional factor in food, by trapping essential nutrients required for good animal performance. However, the low resistance to high temperatures and to the gastric environment of animals can compromise the application of this enzyme, thus reducing the efficiency of nutrient use, with consequent economic and environmental problems. For this purpose, it is necessary to obtain a phytase that is capable of hydrolyzing phytate under these conditions. Thus, understanding the mechanism of action of phytases would allow obtaining phytases with adequate characteristics required for their application. This work aimed at structural analysis and conservation studies of phytases to optimize a phytase for industrial application. Thus, the first part of this work comprises the formation of a phytase database and structural comparative analysis in relation to their biochemical properties, in order to understand factors that influence the stability of these enzymes. Another stage of the research consisted in the study of expression and characterization of phytase from Dendroctonus frontalis, selected among the phytases studied for presenting satisfactory thermal stability. Drying studies of phytase extracts obtained from phytase by lyophilization and Spray Dryer methods were also evaluated. Based on the biochemical properties and the alignment of amino acid sequences of the phytases studied, we observed high variability among the phytases studied, with very different biochemical properties, despite their structural similarity. However, in the comparative structural analysis, the number of Van der Waals interactions, ionic interactions, hydrogen and disulfide bonds that constitute these phytases did not explain the differences in their biochemical properties. The coding sequence of selected phytase was synthesized in plasmid pPICZαB and expressed inPichia pastoris. After cloning and selection of transformants, phytase expression was evaluated in different compositions of culture media and pH. The use of mBMMH and BMMY media at pH 5.0 promoted a 3-fold increase in the level of phytase expression in relation to the expression performed in BMMH. The expressed enzyme had higher activity at pH 4.0 and temperature of 42 °C. However, its stability was affected when submited to temperatures of 70 and 80 °C, for only 1 min. Drying extracts by lyophilization preserved 62 % of the enzymatic activity, compared to the presence of 5% maltodextrin. In the absence of this compound, only 41 % of activity was recovered. The extracts subjected to drying by Spray Dryer, showed higher residual activity at 100 °C and 5 % maltodextrin, above this condition the activity was significantly reduced. Although drying the extracts by Spray Dryer caused a significant reduction in enzymatic activity, its use allowed the powder to be stored for at least 240 days at room temperature, without loss of activity. From this study we can conclude that the mechanism of action of a phytase is closely related to its structure and its efficiency needs to be analyzed individually according to the chosen expression system. This work can help to better understand the mechanism of action of phytases and obtain new phytases for commercial application. Keywords: Phytase. Phytic acid. Enzyme sequence conservation. Industrial application. Enzyme stability.

FAPEMIG -Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais