Contribution à la mise en place d’une plateforme de transgénèse chez la volaille domestique: culture, cryopréservation et ingénierie génétique de cellules germinales primordiales. | Contribution to the setting up of a poultry transgenesis platform: culture, cryopreservation and genetic engineering of primordial germ cells

French. Les cellules germinales primordiales (PGCs) représentent un vecteur de choix pour la transgénèse et l’édition du génome chez la volaille domestique. Elles supportent l'insertion de transgènes de grande taille et, comme précurseurs de la lignée germinale, permettent la transmission de la modification génétique aux générations suivantes. Par ailleurs, vu la difficulté de cryopréserver les spermatozoïdes et, surtout, les ovocytes aviaires, elles représentent un matériel de choix pour la conservation du germoplasme dans ces espèces. Malgré les avantages évidents de l’utilisation des PGCs, les technologies décrites récemment dans la littérature s’avèrent généralement plus difficiles à mettre en œuvre et moins efficaces qu’attendu. Dans ce contexte, nous avons développé et optimisé certaines d’entre elles en vue de les implémenter dans des projets d’ingénierie complexe du génome de la poule. Nous nous sommes d'abord attachés à améliorer l'efficacité de la culture et de la cryopréservation des PGCs. En mettant au point une méthode de culture en inserts présentant une efficacité de près de 40 %, nous avons pu isoler et cultiver à long terme des PGCs issues de 3 souches de poules commerciales et de 2 races locales belges en danger d'extinction. Les cellules présentaient toutes les caractéristiques des PGCs en termes de morphologie, d'expression de marqueurs et de capacité de migration vers les gonades. Nous avons également proposé une méthode de cryopréservation par vitrification, qui montre des résultats supérieurs à ceux obtenus par congélation lente classique. Durant la dernière partie de ce travail, nous avons modifié génétiquement des PGCs pour obtenir des transfectants stables exprimant la GFP. Ces transfectants nous ont permis de vérifier la colonisation gonadique à long terme et la transmission germinale du transgène. Nous avons également testé une méthode de recombinaison site-spécifique par un échange de cassettes médié par la recombinase Cre. Nous avons ainsi développé le savoir-faire nécessaire pour maîtriser l’isolement, l’expansion, l’ingénierie génétique, la réimplantation et la cryopréservation des PGCs de poule et avons montré la possibilité de transmission germinale d'une lignée cultivée à long terme et génétiquement modifiée.

English. Primordial germ cells (PGCs) are the intermediate of choice for domestic fowl transgenesis and genome editing. These can support large transgenes insertions and, as precursors of the germline, can transmit a genetic modification to the next generation. Moreover, given the difficulties for cryopreserving avian gametes (spermatozoa and, above all, oocytes), PGCs represent the material of choice for germplasm preservation in these species. Despite the obvious advantages of PGCs use, recently described related technologies appear generally as more difficult to pursue, and as less effective than expected. In this context, we have developed and optimized some of them which appear as essential for carrying complex chicken genome engineering projects. We first focused on improving the effectiveness of culture and cryopreservation of PGCs. By developing a culture method in inserts, ending up with an efficiency close to 40 %, we were able to isolate and long-term cultivate chickens PGCs from 3 commercial breeds and 2 Belgian endangered local breeds. The cells showed all the characteristics of the PGCs in terms of morphology, markers' expression and gonadal migration. We also applied a cryopreservative vitrification method, which showed results superior to those obtained by conventional slow freezing. During the last part of this work, we genetically engineered PGCs to obtain stable transfectants expressing GFP. These transfectants allowed us to examine long-term gonadal colonization and germline transgene transmission. We also tested a Cre recombinase-mediated site-specific cassette exchange method. As a final result, we have developed the methods and know-how mandatory to allow efficient harvesting, expansion, genetic engineering, reimplantation and cryopreservation of chicken PGCs, and we have shown the possibility of germline transmission of a long term cultured and genetically modified PGCs line.