Análisis de los transcriptos de GDF-9 y BMP-15 en las células del cúmulo y su relación con la maduración in vitro de los ovocitos caninos

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El factor de crecimiento diferencial 9 (GDF-9) y la proteína morfogénica ósea 15 (BMP-15) regulan en diferentes especies procesos esenciales para la maduración del ovocito, tales como la expansión del cúmulo. Este estudio evaluó en caninos la expresión génica de GDF-9 y BMP-15 en las células del cúmulo (CCs) obtenidas de complejos cúmulos ovocitos (COCs) a través del ciclo estral en relación a la maduración in vitro (IVM) de los ovocitos y la expansión de estas células. Las CCs se obtuvieron de COCs de folículos antrales de anestro, proestro, estro y diestro, previo y después de la IVM, expandidas y no expandidas. Para lograr mayor cantidad de CCs, antes y después de la IVM, estas se cultivaron in vitro por 48 h en medio Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) con suero fetal bovino. El desarrollo meiótico luego de la IVM se evaluó mediante microscopía de fluorescencia, clasificándolo en vesícula germinal (VG), reinicio meiótico (GVBD), primera metafase (MI) y segunda metafase (MII). La expresión relativa de GDF-9 y BMP-15 en las CCs se evaluó mediante q-PCR. Estos genes se encontraron en todas las etapas del ciclo antes y después de la IVM, con diferencias significativas entre estas en relación a la expansión y maduración de los ovocitos. De acuerdo a los estados del ciclo estral, en las CCs de COCs no madurados, los niveles de GDF-9 fueron mayores (P < 0,05) durante el estro, seguido por el diestro y los menores (P < 0,05) niveles en proestro y anestro. En BMP-15, los mayores (P < 0,05) niveles de mRNA se observaron en estro y diestro. En las CCs expandidas no hubo diferencias en GDF-9 entre las distintas etapas del ciclo, pero en BMP-15 los menores (P < 0,05) niveles de mRNA se observaron en estro. Luego de la maduración, hubo un incremento (P < 0,05) de los transcriptos de ambos genes en las CCs de anestro, proestro y diestro, excepto los niveles de mRNA de BMP-15 durante el diestro. En estro en cambio, hubo una disminución significativa de la expresión de los dos genes luego de la IVM. No se encontraron diferencias significativas en la capacidad de alcanzar el estado de MII al considerar la etapa del ciclo. Sin embargo, los COCs obtenidos de proestro y diestro que expandieron sus CCs pudieron reiniciar la meiosis en mayor (P < 0,05) porcentaje en comparación con las demás etapas del ciclo y los COCs de estro que expandieron sus CCs lograron mayores (P < 0,05) porcentajes de MII en relación a los que no expandieron el cúmulo. En conclusión, GDF-9 y BMP-15 se expresan en las CCs en todas las etapas del ciclo con un patrón diferente de acuerdo a cada una y estarían involucrados en la expansión del cúmulo de la perra, pudiendo estar relacionado con la maduración meiótica in vitro, al menos en aquellos ovocitos en etapa estral.

Differential growth factor 9 (GDF-9) and bone morphogenic protein 15 (BMP-15) regulate essential processes for oocyte maturation in different species, such as cumulus expansion. This study evaluated gene expression of GDF-9 and BMP-15 in canine cumulus cells (CCs) obtained from cumulus-oocyte complexes (COCs) through the estrous cycle in relation to oocyte in vitro maturation (IVM) and the expansion of CCs. The CCs were obtained from COCs of antral follicles from anestrus, proestrus, estrus, diestrus phases, before and after IVM, expanded and non-expanded. To achieve more CCs, before and after IVM, these were cultured in vitro for 48 h in Dulbecco's Medium Modified Eagle's Medium (DMEM) with fetal calf serum. The meiotic development after IVM was evaluated by fluorescence microscopy, classifying it in germinal vesicle (GV), germinal vesicle breakdown (GVBD), first metaphase (MI) and second metaphase (MII). The relative expression of GDF-9 and BMP-15 in the CCs was evaluated by q-PCR. These genes were found in all stages of the reproductive cycle, before and after IVM, with significant differences between them in relation to the expansion and oocytes maturation. According to the estrous cycle stages, CCs from non-matured COCs expressed higher (P < 0.05) levels of GDF-9 mRNA during estrus in comparison with the other phases and the lowest (P < 0.05) levels at proestrus and anestrus. The highest (P < 0.05) levels of BMP-15 transcripts were observed in estrus and diestrus. There were no differences in GDF-9 gene expression comparing expanded CCs among the different phases of the estrous cycle, regarding BMP- 15 transcripts, the lowest (P < 0.05) levels were registered in estrus. After IVM, the level of both genes increased (P < 0.05) in CCs of anestrus, proestrus and diestrus, except BMP-15 during diestrus. In contrast, in estrus GDF-9 transcripts significantly decreased after IVM. Non expanded CCs exhibited the lowest levels of both genes at anestrus and proestrus, whereas at diestrus the levels of GDF-9 in non-matured CCs were lower (P < 0.05) than that of the expanded cells, the levels of BMP-15 were similar. No differences were found in the oocyte ability to reach MII state when comparing the phases of the estrous cycle. However, COCs obtained from proestrus and diestrus that expanded their CCs showed higher (P < 0.05) percentage of meiosis resumption than to the other phases. At estrus expanded CCs achieved higher (P < 0.05) percentages of MII in comparison to those did not expand. In conclusion, GDF-9 and BMP-15 are expressed in the CCs over the estrous cycle with different patterns according each phase and these genes maybe involved in the cumulus expansion in canines, maybe related to the in vitro maturation, at least in oocytes at estrus phase

Financiamiento: Proyecto Fondecyt 1171670