Arrays and beyond: Evaluation of marker technologies for chicken genomics

Eine zentrale Forschungsfrage in der Nutztierforschung ist, wie die phänotypische Vielfalt von Nutztieren durch ihre genomische Vielfalt geprägt wird. Die genomische Vielfalt wird dabei durch genomische Marker beschrieben. Die Verwendung und Definition von genomischen Markern ist stark technologieabhängig und ändert sich daher im Laufe der Zeit. In den letzten Jahren haben sich Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) zur wichtigsten Markerklasse entwickelt. Außerdem waren SNP-Arrays in den letzten Jahren aufgrund ihrer frühen Verfügbarkeit die Genotypisierungstechnologie der Wahl. Sie werden jedoch derzeit teilweise durch die Ganzgenomsequenzierung (WGS) zur SNP-Bestimmung verdrängt. Darüber hinaus rücken Strukturelle Varianten (SV) mehr und mehr in den Fokus der Forschung. In diesem Zusammenhang zielt die vorliegende Arbeit darauf ab, die Aussagekraft von SNP-Markern auf verschiedene Weise zu bewerten, wobei der Schwerpunkt auf Hühnern als einer vielfältigen Nutztierart mit großer landwirtschaftlicher Bedeutung liegt. In Kapitel 1 wird der aktuelle Wissensstand über genomische Variation, Markertechnologien und deren Einsatz in der Nutztierwissenschaft, insbesondere bei Hühnern, dargestellt. Kapitel 2 und 3 befassen sich dann mit einem systematischen Fehler von SNP-Arrays, dem SNP Ascertainment Bias. Der SNP Ascertainment Bias ist eine systematische Verschiebung des Allelfrequenzspektrums von SNP-Arrays hin zu häufigeren SNPs aufgrund der Vorauswahl von SNPs in einer begrenzten Anzahl von Individuen aus wenigen Populationen. Kapitel 2 zielt darauf ab, das Ausmaß des Bias für einen Standard-SNP-Array für Hühner und die Schritte des Array-Designs, die den Bias verursacht haben, zu bewerten. In der Studie haben wir daher den Designprozess des Hühnerarrays auf der Grundlage von (gepoolten) WGS verschiedener Hühnerpopulationen nachgestellt. Dabei zeigte sich eine sequentielle Reduktion seltener Allele während des Designprozesses, die vor allem durch die anfängliche Begrenzung des Discovery Sets und eine spätere Selektion von häufigen SNPs innerhalb der Populationen bei gleichzeitigem anstreben von äquidistanten Abständen verursacht wurde. Eine Vergrößerung des Discovery Panels hatte den größten Einfluss auf eine Begrenzung des Ascertainment Bias. Andere Schritte, wie z. B. die Validierung der SNPs in einem breiteren Set von Populationen, zeigten keine relevanten Auswirkungen. Korrekturmethoden für den Ascertainment Bias sind in Studien bisher meist nicht durchführbar. In Kapitel 3 wird daher vorgeschlagen, die Imputation der Array-Daten auf WGS-Niveau als in silico Korrekturmethode für das Allelfrequenzspektrum zu verwenden. Die Studie zeigte, dass die Imputation in der Lage ist, die Auswirkungen von Erhebungsfehlern stark zu reduzieren, selbst wenn ein sehr kleines Referenzpanel verwendet wurde. Es wurde jedoch auch deutlich, dass das Referenzpanel dann den gleichen Effekt wie das Discovery-Panel während des Array-Designs hat. Daher ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Proben für das Referenzpanel gleichmäßig über das Populationsspektrum verteilt ausgewählt werden. SVs sind schwieriger zu bestimmen und zu genotypisieren als SNPs. Daher stellt sich die Frage, ob die Effekte von SV auch durch SNP-basierte Studien erfasst werden. Das wäre der Fall, wenn zwischen SNPs und SVs ein starkes Kopplungsungleichgewicht (LD) besteht. Dies wird in Kapitel 4 für drei kommerzielle Hühnerrassen auf der Grundlage von WGS-Daten untersucht. Die Studie zeigte, dass das LD zwischen Deletionen und SNPs auf dem gleichen Niveau lag wie das LD zwischen SNPs und anderen SNPs, was darauf hindeutet, dass Effekte von Deletionen von SNP-Marker-Panels genauso gut erfasst werden wie SNP-Effekte. Das LD zwischen SNPs und anderen SVs war stark reduziert. Der Hauptfaktor für diese Verringerung waren lokale Unterschiede zu SNPs in Bezug auf die Minor-Allel-Frequenz. Eine Reduktion der homozygoten Varianten für Nicht-Deletions-SVs im Vergleich zur Erwartung unter Hardy-Weinberg-Gleichgewicht kann jedoch auf Probleme der verwendeten SV-Genotypisierer hinweisen. Im letzten Kapitel (Kapitel 5) werden die Auswirkungen des Ascertainment Bias und die Möglichkeiten, damit in der Hühnergenomforschung (und auch generell in der Nutztiergenomforschung) umzugehen, diskutiert. Außerdem werden die Möglichkeiten der Einbeziehung von SV in Studien bewertet. Es wird auch erörtert, was notwendig ist, um die Informationen aus verschiedenen genomischen Datensätzen zu kombinieren damit der Aussagewert von Studien erhöht wird. Abschließend wird ein Ausblick darauf gegeben, welche Informationen aufgrund der jüngsten technologischen Fortschritte in naher Zukunft zusätzlich verfügbar sein werden.

A key research question in livestock research is how livestock’s phenotypic diversity is shaped by its genomic diversity. Genomic diversity is thereby assessed through genomic markers. The use and definition of genomic markers is strongly technology driven and therefore changes through time. During the last years, single nucleotide polymorphisms (SNPs) have become the main marker class. Additionally, SNP arrays have been the genotyping technology of choice during the last years due to their early availability. They are, however, currently partially displaced by whole-genome-sequencing (WGS) for SNP calling. Further, structural variants (SV) are moving more and more into the focus of researchers. In this context, the thesis aims in evaluating the value of SNP markers in various ways with its main focus on chickens as a diverse livestock species with major agricultural value. In Chapter 1, the current knowledge of genomic variation, marker technologies, and their use in livestock sciences, especially in chickens, is reviewed. Chapter 2 and 3 then address a systematic error of SNP arrays, the SNP ascertainment bias. SNP ascertainment bias is a systematic shift of the allele frequency spectrum of SNP arrays towards more common SNPs due to the pre-selection of SNPs in a limited number of individuals of few populations. Chapter 2 aims in assessing the magnitude of the bias for a standard chicken SNP array and the steps of array design that created the bias. In the study, we therefore remodeled the design process of the chicken array based on (pooled) WGS of various chicken populations. This revealed a sequential reduction of rare alleles during the design process, which was mainly caused by the initial limitation of the discovery set and a later within-population selection of common SNPs while aiming for equidistant spacing. Increasing the discovery set had the largest impact on limiting ascertainment bias. Other steps, as e.g. validation of the SNPs in a broader set of populations did not show relevant effects. Correction methods for ascertainment bias are by now often unfeasible in studies. Chapter 3 therefore proposes to use imputation of the array data to WGS level as an in silico correction method of the allele frequency spectrum. The study revealed that imputation is able to strongly reduce the effects of ascertainment bias, even when a very sparse reference panel was used. However, it became also obvious that the reference panel then has the same effect as the discovery panel during array design. It is therefore crucial to select samples for the reference panel evenly spaced across the intended range of populations. SVs are harder to call and genotype than SNPs. Therefore, the question arises whether effects of SV are captured by SNP-based studies due to strong linkage disequilibrium between SNPs and SVs. This is assessed in Chapter 4 for three commercial chicken breeds, based on WGS data. The study showed that LD between deletions and SNPs was on the same level as LD between SNPs and other SNPs, indicating that deletion effects are captured by SNP marker panels as good as SNP effects. LD between SNPs and other SVs was strongly reduced. The main factor for this reduction was local differences to SNPs in terms of minor allele frequency. However, a reduction of homozygous variant calls for non-deletion SVs compared to the Hardy-Weinberg-expectation may indicate problems of the used SV genotypers. In the last chapter (Chapter 5), the impact of ascertainment bias and possibilities to deal with it in chicken genomics (and also more general in livestock genomics) is discussed. Further, the potentials of including SVs into studies are evaluated. It also discusses what is necessary to combine the information of different genomic data sets to leverage the value of analyses. Finally, an outlook on what information will be additionally available in near future based on recent technological advances is given.

2022-01-11